别让样品制备拖了测序的后腿

【字体：大中小】 时间：2012年09月24日 来源：生物通

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　　炙手可热的第二代测序技术NGS在研究界可谓是家喻户晓，NGS在降低DNA分析成本的同时大大提高了通量，但其样品制备依然繁琐。不过，我们绝不能让NGS文库制备拖了后腿。一款趁手的好工具不仅能帮我们省时省力，更能为实验结果保驾护航。本文就为您介绍了目前市面上的一些样品制备产品。

炙手可热的第二代测序技术NGS在研究界可谓是家喻户晓。不论是Illumina达到生产规模的HiSeq®测序仪，还是Life Technologies的个人化Ion Torrent PGM测序仪，都能以惊人的效率对基因组和转录组进行解码，而这一切是我们在十年前做梦也想象不到的。

大家的目光都聚焦在二代测序仪本身及其功能上，不过要享受仪器带来的便利，我们首先还得准备好测序样品，这可绝不仅仅是提个DNA而已。

目前市面上已有不少试剂盒，能够简化将DNA样本转为测序文库的步骤，使其更加标准化，还能支持多重测序。如果您只希望对外显子或者甲基化区域进行测序，还可以选择相应的靶向富集系统。

随着二代测序应用的不断延伸，五花八门的样品制备工具自然不会缺。不论您是希望手动进行实验还是使用自动化液体工作站，都能找到称心合意的产品。

文库制备的关键步骤

测序文库指的是连有相应的接头一系列DNA片段，其长度和接头序列都适于测序仪进行处理。当然，文库制备的步骤取决于您的应用和所选择的测序仪。例如，要构建转录组文库就需要进行cDNA合成，要制备ChIP-seq文库当然也少不了ChIP。用于单方向测序的文库与末端配对文库的制备步骤也是不同的。

不过Life Technologies副总裁Mark Gardner介绍道，文库制备过程通常都包含一些与测序平台无关的核心步骤，例如DNA提取、片段化和size-selection，末端处理和clean-up，连接接头序列并扩增所得片段。

DNA片段化一般采用超声来处理，不过您也可以选择使用特殊的酶，例如NEB公司的NEBNext® dsDNA Fragmentase®。Life Tech为其Ion Torrent用户推荐的是Diagenode Bioruptor® UCD-200超声破碎仪，而SOLiD用户则被建议使用Covaris™ S220超声破碎系统。Illumina也同样为其TruSeq样品制备试剂盒的用户推荐了Covaris超声破碎系统

Gardner还推荐用Life Technologies的琼脂糖凝胶产品E-Gel® SizeSelect™ 凝胶或Pippin Prep™试剂盒来进行size selection。而Illumina则建议大家使用贝克曼家的AMPure XP磁珠。

当我们开始构建文库时，Illumina公司的TruSeq DNA Sample Preparation试剂盒和TruSeq RNA Sample Preparation二代试剂盒都是不错的选择。在TruSeq试剂盒的工作流程中，“clean-up”步骤包括使片段末端平端化，然后通过A-tailing给片段贴上3’-腺嘌呤残基以便连接接头。

Illumina公司负责测序系统及耗材市场推广的Jeremy Preston主管介绍道，这些接头都含有条码（或索引）序列，可以支持多重反应。 “低通量”的TruSeq DNA LT试剂盒拥有24个条码序列，而新发布的TruSeq DNA HT试剂盒的条码序列则多达96个。

“您可以在不同孔中制备不同的样品，然后将其混合在一起在一个通道中进行测序，”Preston解释道。“在实际操作中并不会产生额外步骤，这是因为我们在添加接头时就已经包含了条码信息。”

Illumina公司还提供另一类产品，这是该公司收购Epicentre公司后得到的Nextera系列产品，这类产品采用以“transposome”为基础的快速技术，能够在对DNA进行片段化的同时添加标签，该过程被称为tagmentation。据该公司的资料称，这种试剂盒的第一步仅需15分钟，而第二步就能够通过PCR添加测序引物和多达96个条码。正因如此，这种试剂盒的整个工作流程比TruSeq要快得多，TruSeq试剂盒的工作流程通常需要8-12个小时，而Nextera能在90分钟内完成。更吸引人的是Nextera试剂盒仅需50ng DNA，而TruSeq试剂盒需要1µg。

Life Tech公式也为自家Ion Torrent打包提供样品制备和加条码试剂盒，例如Ion Xpress™ Plus Fragment Library试剂盒和NuGEN® Encore™ Library系统，当然还有专为SOLiD设计的SOLiD® Fragment Library Construction试剂盒。罗氏公司也有样品制备和条码试剂盒提供，包括GS FLX Titanium Rapid Library Preparation试剂盒以及一些相关试剂。

当然，除了测序仪生产商以外，您也可以选择第三方供应商提供的文库制备试剂盒。NEB Biolab产品经理Fiona Stewart介绍说，他们为Illumina、Ion Torrent、SOLiD和Roche/454提供了三十多种NEBNext试剂盒用于制备DNA和RNA文库。这些试剂盒中的酶、接头和文库构建方式各不相同，例如有的使用平末端连接有的使用A-tailing等。

这些试剂盒的配置方式也不同，Stewart介绍道。用户们可以选择购买整套预混液，也可以选择专为不同步骤提供的未预混试剂组合。当然您还可以购买大包装或者进行定制，为您的特殊样品调整实验流程。“我们能够以任何用户所需的形式来配置试剂，”她说。

自动化平台，省心省力重现性好

即使我们采用了试剂盒，NGS样品制备依然是个及繁杂又费力的过程。贝克曼库尔特公司基因组解决方案市场经理Alisa Jackson说，尤其是在操作多种样品时，很容易发生错误或引入人为的可变因素。

“的确，第二代测序在降低DNA分析成本的同时大大提高了通量，但样品制备依然繁琐，”Jackson说。“而且许多研究者们并不希望再浪费时间精力来进行手动操作。”

为此贝克曼库尔特公司开发了自动化的样品制备系统，Illumina等一些测序仪生产商也已在供应适用于自动化技术的即用型试剂盒。当然，贝克曼库尔特公司自己也开发了相应的文库构建试剂，从而为用户提供了从低通量到高通量处理的一整套自动化解决方案。这包括低通量的SPRIworks Fragment Library Systems I、II、III（分别对应Illumina平台/罗氏454、SOLiD 4400、Ion Torrent 100 bp读取），和高通量的SPRIworks HT (默认是为Illumina配置的，不过也可由客户自行定制)。

SPRIworks Fragment Library Systems I–III适于在SPRI-TE工作站上使用，是专为二代测序平台量身定制的配套设备，其试剂耗材都是即用型，操作十分简单。该系统可以同时处理10个样本，在4至5小时之内完成文库构建的4个关键步骤（end-repair、A-tailing、ligation、以SPRI固相可逆固定为基础的size-selection和clean-up），不需要进行手工加样、柱纯化以及切胶回收。您只需将初始样品管和试剂盒放入仪器中，点击菜单即可运行。

高通量的SPRIworks HT适用于配有Span-8和96通道移液头的Biomek FX系统，该试剂盒能够进行文库构建、PCR setup和cleanup。SPRIworks HT除了具备与SPRIworks I–III相同的功能以外，还能够为最后的扩增步骤进行PCR setup。此外，SPRIworks HT还能进行qPCR setup并且可以混合样品以备多重测序。据Jackson介绍，如需进行size selection该产品能在6小时内生成96个文库样本，若剔除size selection步骤，整个文库制备过程仅需4个小时。SPRIworks HT的默认配置是为Illumina测序平台制备文库，不过由于该产品是基于Biomek的开放性平台，您也可以向公司定制来适应其他应用。

Life Tech公司也为自动化的液体工作站提供了预制试剂盒，Gardner还推荐了另一款自动化工作平台，Applied Biosystems Library Builder™。Library Builder平台能够自动进行文库制备的所有步骤，而且产品资料称它还能够进行上游的DNA纯化步骤，“将人工操作时间减少了一半”。

靶向富集，只关心您想要的

与以往相比NGS的价格的确大幅降低了，不过第二代测序也并不便宜。我们作为用户当然希望在一次测序中能分析的样品和序列越多越好。当然，加条码就是一个好办法。我们可以给每个片段加上标签或者条码序列，将其混在一起进行测序，然后在后期数据分析时利用生物信息学软件以条码序列为依据区分不同样品。

如果只需要对特殊基因或者转录组进行测序，我们还可以进行靶向富集，这一方法通常与条码配合使用。这样分析不同样本所需的序列就更少了，在一次测序中处理更多的样本。

使用安捷伦公司的SureSelect™系统来进行靶向富集相当普遍，该产品通过连有生物素的RNA寡核苷酸来与特定目标区域结合，形成RNA:DNA杂合体，再利用连有链霉亲和素的磁珠进行捕获。

安捷伦公司NGS产品市场主管Olle Ericsson介绍道，该公司的SureSelect™现货产品适用于捕获30 Mbp人类外显子（SureSelectXT Human All Exon v4）和X染色体，以及甲基化区域测序研究（SureSelectXT Human Methyl-Seq），同时也接受客户定制。

在安捷伦公司您还可以定制基于多重PCR的富集技术，HaloPlex。临床研究的关键是简便性和可重复性，而 HaloPlex就相当适用，还能与桌面型benchtop测序仪结合使用。您可以使用免费的在线设计向导（Web Design Wizard），不到 10分钟时间就可完成设计，富集数以千计的目标基因组序列。

Life Tech和Illumina也有以杂交技术为基础的靶向富集产品，分别是TargetSeq™ 和TruSeq系列的相应产品。此外，与安捷伦类似，LifeTech也有以PCR为基础的富集产品，AmpliSeq。AmpliSeq可以用于癌症和遗传疾病研究，当然您也可以根据自己的需要进行定制。

很快市面上的靶向富集产品会越来越多。不久，Qiagen公司就会发布新产品GeneRead rRNA Depletion试剂盒，该产品能够有效从总RNA样品中去除核糖体RNA以提高RNA-seq的灵敏度。据称这款新产品的与众不同之处在于，它并非使用连有生物素的杂交探针，而是采用了一种特异性识别RNA:DNA杂合体的特殊抗体。Qiagen公司的副总裁Dirk Loeffert介绍道，该产品能够保证只特异性地捕获混合物中的核糖体序列。“我们能够去除超过99.9%的rRNA，”他说。