如何获得高质量、高可信度的荧光定量PCR结果[心得点评]]

——高质量cDNA标准

荧光定量PCR（Real-time PCR）是目前基因表达定量分析的重要检测手段，已经为越来越多的研究者所采用。“好的开始是成功的一半”，Perrez-Novo等(Perrez-Novo et al., 2005)曾报道获得高质量RNA对后续PCR定量结果的准确性是非常重要的，而高质量RNA是获得高质量cDNA的必要条件，所以本文着重介绍一下如何获得高质量cDNA。

高质量cDNA应具备以下几个特点：无基因组DNA残留、能准确反应出样本真实的转录情况和信息完整且浓度适当等特点。

高质量cDNA应保证无基因组DNA残留

在提取RNA的过程中，常常会有基因组DNA的残留，从而导致实验结果的不准确性或假阳性结果的出现。2008年，Nature Protocol的一篇关于荧光定量PCR实验研究的文章1中明确指出，在合成cDNA第一链之前应去除基因组DNA残留，以免cDNA中有基因组DNA的存在，影响高灵敏度的荧光定量PCR实验结果：

那么，如何避免基因组DNA对荧光定量PCR结果的影响呢？对于真核生物，由于内含子的存在，可以选择跨内含子设计引物的方法来避免基因组DNA及假基因（Pseudogenes）的影响。如分别在相邻的两个外显子上设计qPCR引物，这样基因组DNA的扩增片段与cDNA扩增片段相比就增加了一个较大的内含子，而荧光定量PCR的延伸时间很短，很难扩增出大片段，如果使用SYBR Green方式检测，一旦有来源于基因组的扩增片段出现也可以在分析溶解曲线时发现。而对于原核生物，必须经过DNase I消化去除基因组DNA；但是，很多实验者发现，跨内含子设计引物有时的实验结果不佳，原因可能是基因组DNA增加了模板的复杂性，与目的模板竞争引物和酶等，可能导致PCR扩增效率的下降，影响定量结果的准确性；另外，并不是每个基因都能在相邻的且大小合适的外显子上找到合适的跨内含子引物，所以，很大部分实验需要在一个外显子上设计引物，这时就必须经过去除基因组DNA步骤，才能得到准确可靠的结果。

传统基因组DNA去除的方法采用对RNA进行处理，由于引入了蛋白（DNase I），后续需要进行氯仿抽提纯化，操作繁琐，耗时长，RNA的回收率低。TIANGEN公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（KR106，TIANGEN），将基因组DNA去除完美整合到反转录步骤中，采用全新的gDNase Buffer，可3 min快速去除基因组DNA残留，操作简便，无需氯仿抽提纯化步骤；而后利用高效FastQuant RT Enzyme 完成cDNA第一链的合成及gDNase灭活仅需18 min，并且所有反应均在同一离心管中完成，大大简化了操作步骤，节省了时间，被称为“21 min的一管式革命”。

高质量cDNA应能准确反映样本真实的转录情况

RNA纯化方法多种多样，包括有机溶剂沉淀法，硅基质膜吸附法，玻璃纤维素膜吸附和磁珠法等，那么，怎样选择适合自己的纯化方法呢？就要根据样本类型及后续实验对RNA质量待需求来进行综合考虑。高质量RNA应能准确反映样本真实转录情况的转录池（transcript pool）。

一般有机溶剂沉淀法对样本的起始量没有严格限制，获得的是包含总RNA和小RNA在内的总RNA，用沉淀法可以得到浓度较高或较为大量的RNA，多用于Northern Blot等RNA需求量大的实验；硅基质膜吸附法一般用于纯化片段较大的总RNA，mRNA保留比较完整，纯度高，多用于RT-PCR或Real-Time PCR分析；玻璃纤维素膜常用于纯化片段较小的RNA片段，纯度较高，经常用于microRNA等小RNA的分离实验；磁珠法一般用于RNA含量较少的样本，获得的RNA量比膜吸附法高，但纯度略低。

在进行高通量药物筛选，干细胞或胚胎细胞等研究时，经常需要对单个细胞或数百个细胞的微量样本进行分析，这时，以上几种常规纯化方式均很难完整地保存RNA信息。直接裂解细胞是获得少量细胞RNA的最好方法，不经介质吸附洗脱过程，无RNA损失。这就需要裂解液即可迅速裂解细胞，高效的保护RNA，又不会影响高效反转录反应，且对于后续荧光定量PCR无抑制作用。 FastLine细胞到cDNA快速制备试剂盒（KR105，TIANGEN），一站式完成从细胞到cDNA的快速制备，同时去除基因组DNA残留，整个操作流程仅需50 min，获得的cDNA不但可以直接进行荧光定量 PCR还可以和正常提取RNA后进行第一链反转录后得到的cDNA一样，冷冻保存供以后使用，是从少量细胞快速制备cDNA的最佳选择，并可实现高通量检测。
 
高质量cDNA应具备信息完整性好和浓度高的特点

cDNA的信息完整性和浓度是由RNA的质量和反转录效率所共同决定的。

1. 高质量的RNA模板是获得高质量cDNA的首要条件，应具备纯度高（不含抑制剂）和完整性好的特点，纯度高可保证不对后续反转录反应产生抑制作用，完整性好才可保证cDNA的信息完整性。下面具体介绍一下RNA质量的评价标准：

1) RNA纯度评价
一般采用紫外分光光度计对RNA纯度进行评价，例如Nanodrop。
OD260/OD280＝1.9 ～2.1，代表高纯度的RNA；
OD260/OD280 < 1.9，表明有蛋白质残留；
OD260/OD280 > 2.1，表明RNA有部分降解，可经琼脂糖凝胶电泳进一步确定；
OD260/OD230 < 2.0,表明有盐离子残留。
注意：如用RNase-Free H2O溶解RNA，会导致OD260/OD280值偏低，但不影响RNA的质量。此方法不能反映基因组DNA的残留情况，需进行琼脂糖凝胶电泳进一步鉴定。

2) RNA完整性评价
一般可通过常规琼脂糖凝胶进行完整性和质量评价。真核生物的28S和18S rRNA电泳条带明显，且比率接近2：1，表明RNA完整性好，没有降解。另外，此方法亦可反映出严重的基因组DNA残留和蛋白残留情况，但痕量的基因组DNA残留无法被检测出来，却会影响灵敏度极高的荧光定量PCR实验结果。

2. 高效反转录酶是获得高质量cDNA的必要条件，理想的反转录酶应具备反转录效率高，RNase H活性低，复杂模板通读能力强和操作便捷等特点，目前市场上的逆转录酶分为以下三代：

1) 第一代是AMV，它来源于禽成髓细胞瘤病毒，由于其两个游离肽键的特性，其反转录性能可以达到50-60%，但是，其具有RNase H活性，能够降解反转录反应中模板RNA，当进行较长片段的反转录时，就会造成cDNA的信息不完整。

2) 第二代是M-MLV，来源于Moloney鼠白血病病毒，它大大降低了RNase H的活性，但仅有一个游离肽键，所以反转录效率仅为30-40%，需要较大量的RNA模板，这样，与高丰度RNA的竞争会导致低丰度RNA的反转录效率更低，使cDNA无法反映样本真实的转录情况，甚至因检测灵敏度过低而导致实验失败。

3) 由于前两代酶的不理想，以TIANGEN的Quant系列为代表的第三代酶在市场上显现出了很强的增长势头。Quant是大肠杆菌重组酶，具有90%的革命性反转录效率，使RNA基本完全转录为cDNA，保证了低丰度RNA的检测灵敏度；完全不具有RNase H活性，保证了cDNA的信息完整性，并且具有革命性的复杂模板通读能力，可对高GC含量的RNA进行高效逆转录；另外，还在操作简便性上有了革命性的变化，是目前市场上最优质的反转录酶。

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