专访黄健博士：大规模肝癌外显子测序研究

日前生物通有幸联系到了近期在Nature Genetics杂志上发表重要肝癌研究成果的黄健博士。这项重要研究成果利用先进的外显子组测序技术对乙型肝炎病毒相关的肝癌开展了大规模的测序和分析研究……

　　

前言：

肝癌是一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤，素有“癌王”之称，据估计全世界每年新发现肝癌大约为100万左右，在常见肿瘤中排名第五（占恶性肿瘤5％左右），其中40％发生在中国。

 

因此其相关研究领域也备受关注，近期由韩泽广、黄健等人领导的上海交大医学院附属瑞金医院和国家人类基因组南方研究中心等处的研究组利用先进的外显子组测序技术对乙型肝炎病毒相关的肝癌开展了大规模的测序和分析研究。

 

这一研究为我们提供了可能与中晚期肝癌相关的体细胞突变的图谱，并为人们发现有关驱动肝癌发生及生长分子途径提供了重要的线索。

 

日前生物通有幸联系到了黄健博士，就该项重要研究的相关内容请教了本人。

（黄健研究员，图片来源：黄健研究员）

 

【生物通】请问你们的研究为什么会选择肝细胞癌，特别是肝内转移性肝细胞癌作为研究对象？

【答】肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是原发性肝癌（Primary Liver Cancer）的主要形式，也是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一。据估计全世界每年新发现肝癌大约为100万左右，在常见肿瘤排名第五（占恶性肿瘤5％左右），其中40％发生在中国。肝细胞癌在我国有“癌王”的称号。肝癌的发病率在不同地区有很大的差异。在西非、中非和东非，肝癌是主要的恶性肿瘤。但在欧美大部分地区、北非和中东属罕见肿瘤。国内普查资料表明，肝癌的发病率为14.58～46／10万。全国死亡原因回顾调查显示，肝癌在男性中平均死亡率为14.52／10万，仅次于胃癌和食管癌，占恶性肿瘤第三位；女性为5.61／10万，死亡率仅次于胃癌、宫颈癌和食管癌，占恶性肿癌第四位。肝癌研究在最近的几十年取得了可喜的进展，然而整个人群的肝癌5年生存率，无论东方还是西方，仍然很低。

目前，人们对肝癌的发病机制的了解还不甚清楚，特别是肝癌转移的分子机制。临床实践发现，肝癌的转移发生率较高。甚至早期小肝癌亦可能已有肝外转移。通常多先有肝内播散，然后出现肝外转移。肝内直接扩散是指癌细胞通过肝窦或窦旁间隙，直接扩散到肝内其他部位，转移癌灶呈卫星状分布，也可远离原发癌。此外，癌细胞可侵犯门静脉并形成门静脉癌栓，如癌栓脱落在肝内，则引起肝内多发性转移灶；门静脉主干被瘤体阻塞，可引起门静脉高压和顽固性腹水，最终引起死亡。

因此，在21世纪积极开展肝癌的防治研究仍有其紧迫性和必要性。我国中长期科技发展规划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项中就包括针对HBV相关肝细胞癌的基础和应用研究。因此，选择肝癌为研究对象，就是想利用先进的科学技术解决我国自己的事情，为最终消灭严重危害我国人民身心健康的“癌中之王”提供理论依据和技术支撑。

 

【生物通】能否简略谈下课题的研究思路，有何重要发现？这些发现的意义是什么？

【答】我们知道，转移发生率与肝癌的生物学特性密切有关，特别是肝癌细胞内促转移基因和抑癌基因的平衡失调在肝癌转移中起到重要作用。因此，利用先进的分析技术，系统研究肝癌和正常细胞之间基因谱系的差别，就有可能发现与肝癌转移密切相关的基因变异类型，为临床诊断和治疗提供新指标和新靶点。

具体来讲，我们选择了10例HBV阳性肝癌患者，收集每一例患者手术后的癌旁组织、原发癌组织和肝内转移的门静脉癌栓。利用基因组学领域内的最先进的DNA序列分析仪，对这些样本进行全外显子组测序分析，结合生物信息学技术仔细识别每一例患者的三种样本间的DNA序列的微小差异，从而发现在肿瘤细胞存在347个突变基因，平均每个肿瘤样本有30-40个基因突变，其中大多数基因突变是第一次在肝癌细胞中被发现，并且在原发灶和转移灶中同时出现。说明肝癌的发病和转移与基因突变密切相关，并且转移相关基因在原发癌中就已经发生了突变。随后我们在更大规模的肝癌样本中对基因突变进行了验证，证明我们的结果是准确可信的。此外，我们又利用RNA干扰技术评估了91个已证实存在突变的基因对肝癌细胞生长的影响，发现ARID1A、VCAM1和CDK14等基因突变可能与肝癌发生、转移密切相关。

特别是，ARID1A基因突变在多种人类肿瘤中均被发现有突变发生，比如：卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、肾癌、膀胱癌等。在我们的这项研究中，ARID1A基因在13%肝癌组织中均发生突变。有同行预测，该基因有可能是继TP53基因之后，又一个肿瘤基础研究和开发应用的明星分子。此外，VCAM1除了突变外，还在多数肝癌样本中表达下降。而与细胞增殖相关的CDK14基因突变则会增强该基因功能，导致细胞生长加快，促进转移。

当前的研究成果为未来开发临床可用的诊断试剂和药物提供了新的线索。在此基础上，我们正在进行后续的更大规模的深入研究。

 

【生物通】你们研究的目的是筛选乙型肝癌特异的突变基因。基因芯片同样是高通量的技术手段，为何不选用基因芯片，而选用高通量测序技术呢？

【答】基因芯片和基因测序是目前主要的高通量基因组学筛选工具。基因芯片操作简单，数据分析便捷，但是基因芯片上的探针是已知序列，只能检测已知序列的基因变异。高通量测序虽然成本较高，实验和数据分析较困难，但是它既能发现已知基因位点的变异，也能发现以前没有发现过的基因突变，获得的信息量比基因芯片技术多得多。本课题的研究目的就是想系统研究全部基因区域在肝癌和癌栓细胞与癌旁细胞之间的差异，包括已知的基因变异，也包括未知的新的基因变异，只有这样，才能全面了解肝癌和转移灶中特异性的基因突变，为深入研究奠定扎实的基础。

 

【生物通】你们的研究中为何要同时选用Illumina/Solexa sequencing和ABI SOLiD sequencing这两个相似的技术平台呢？此外，众所周知高通量测序技术面临的一个问题就是数据分析，您在这项研究中是否也遇到了这个问题？您是如何解决的？

【答】目前，国际上常用的高通量测序技术有Illumina公司的Solexa系统、ABI公司的 SOLiD系统以及Roche公司的454系统。前二种所获得的序列较短，但序列的数量比较多，而454系统虽然序列比较长，但一次实验所获得的序列总数较少。所以我们选择了前二种平台进行我们的研究工作。为什么同时选择二种平台呢？因为，每种技术都有他们固有的优点，同时也会有不足之处。我们在2年前启动这项研究时，并不清楚每种平台的不足之处到底会对我们的研究工作有多大的影响。所以，为了尽可能地减少技术本身的不足之处，我们首先使用Illumina公司的Solexa系统进行序列分析，然后再用ABI公司的 SOLiD系统对相同的样本进行二次分析，选择二种技术共同检测到的基因变异位点作为后续研究的最终数据集。这样做可以最大限度地确保结果的准确性，当然研究成本也大大增加了，但是为得到准确的结果，这是值得的。

    你说得很对，高通量测序技术面临的最大问题就是数据分析。我本人在博士研究生期间，在我的指导老师韩泽广教授带领下，利用Solexa系统的前身技术MPSS平台，完成了我国首例肝脏转录组的测序和分析工作，当时序列的长度是18bp，在理解大规模数据上我们花了较长的时间，最终的研究成果也被国际同行认可。去年，我带领一个团队，完成了中国首个“百种单基因遗传病”的高通量测序和数据分析工作。该项研究建立的技术一次可以同时检测100种单基因遗传病致病基因的变异谱，不仅可以发现已知的突变类型，而且可以发现新的基因突变，为产前诊断和遗传咨询奠定了很好的基础。这些经验都为这一次的研究工作顺利完成奠定了基础。该项研究在国家科技部973计划和卫生部“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项等支持下，国家人类基因组南方研究中心主导，联合生物芯片上海国家工程研究中心、上海伯豪生物技术有限公司，以及国内多家知名医院等共同完成。

下一步，我们将继续对肝细胞癌进行更深入的研究，比如我们正在针对肝细胞癌的全基因组和全转录组序列数据进行整合分析，试图从一个全新的视角解读肝癌发生和发展规律；此外，在国家自然基金和上海市科委重点项目资助下，我们正在系统研究肝癌的甲基化和羟甲基化谱，并探讨二种谱系的异常对基因表达的影响。这些都是基于高通量数据的分析，希望我们的研究成果能够对人们全面认识肝癌，并最终攻克肝癌提供帮助。

 

原文摘要：

Exome sequencing of hepatitis B virus–associated hepatocellular carcinoma

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers worldwide and shows a propensity to metastasize and infiltrate adjacent and more distant tissues1. HCC is associated with multiple risk factors, including hepatitis B virus (HBV) infection, which is especially prevalent in China. Here, we used exome sequencing to identify somatic mutations in ten HBV-positive individuals with HCC with portal vein tumor thromboses (PVTTs), intrahepatic metastases. Both C:G>A:T and T:A>A:T transversions were frequently found among the 331 non-silent mutations. Notably, ARID1A, which encodes a component of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, was mutated in 14 of 110 (13%) HBV-associated HCC specimens. We used RNA interference to assess the roles of 91 of the confirmed mutated genes in cellular survival. The results suggest that seven of these genes, including VCAM1 and CDK14, may confer growth and infiltration capacity to HCC cells. This study provides a view of the landscape of somatic mutations that may be implicated in advanced HCC.

黄健简介

黄健：博士，研究员。生物芯片上海国家工程中心肿瘤基因组学转化应用研究室主任，研究方向是肿瘤基因组学和分子遗传学：利用基因芯片和高通量测序技术及生物信息学手段，系统分析肿瘤（肝癌）基因组、转录组和甲基化组的变异，并探讨各种变异与临床特征的关联性，结合细胞学和动物学技术识别鉴定与肿瘤相关的重要功能基因，深入研究其在肿瘤发生发展中的分子机制，为肿瘤的临床诊断提供新的指标，或为最终治愈肿瘤提供潜在的药物靶点；

先后承担多项国家“863”计划项目、国家“973”项目、国家自然基金、国家博士后资助计划一等资助，上海市科委自然科学基金重点项目，上海市学术技术带头人项目、深圳市生物产业高技术产业项目等。相关研究先后发表在Nature Genetics、JCI、PNAS、Carcinogenesis、Cancer Research、FEBS Lett、BMC Genomics、Molecular Carcinogenesis、Genomics、BMC Cancer、PLOS ONE、J Proteome Res、J Hepatol等国际杂志上。获得三项上海市科研成果奖，六项国家发明专利，参与编写专著二部。

 

学习经历：

1984-1987，江苏省卫生学校，医学检验；

1993-1997，江苏徐州医学院，临床医疗；

2000-2003, 江苏徐州医学院（硕士研究生），肿瘤学；

2004-2007, 复旦大学（博士研究生），分析化学。

2007-2009，上海交通大学（博士后），肿瘤基因组学和分子遗传学

 

工作经历：

1987-1995, 徐州医学附属医院检验科，医学检验师；

1995-1997, 徐州医学附属医院医务科，主管检验师；

1997-2000, 徐州医学附属医院中心实验室，主管检验师；

2001-2003, 国家人类基因组南方研究中心，客座研究；

2004-2009.11, 国家人类基因组南方研究中心，课题组长；

2009.11-2011.6 深圳华大基因研究院健康事业研发部主任；

2011.6-至今生物芯片上海国家工程中心肿瘤基因组学转化应用研究室主任；上海市疾病与健康基因组学省部共建重点实验室课题组长。

部份发表的研究论文目录：

1.       Jian Huang, Qing Deng, Qun Wang, Kun-Yu Li, Ji-Hong Dai, Niu Li, Zhi-Dong Zhu, Bo Zhou, Xiao-Yan Liu, Rui-Fang Liu, Qian-Lan Fei, Hui Chen, Bing Cai, Boping Zhou, Hua-Sheng Xiao, Lun-Xiu Qin & Ze-Guang Han. Exome sequencing of hepatitis B virus–associated hepatocellular carcinoma. Nauture Genetics. Published online: 26 August 2012 | doi:10.1038/ng.2391

2.       Wei X, Ju X, Yi X, Zhu Q, Qu N, Liu T, Chen Y, Jiang H, Yang G, Zhen R, Lan Z, Qi M, Wang J, Yang Y, Chu Y, Li X, Guan Y, Huang J*. Identification of Sequence Variants in Genetic Disease Genes using Targeted Next-Generation Sequencing. PLoS One. 2011;6(12):e29500. Epub 2011 Dec 21.

3.       Jian Huang, Dali Zheng, Yun-Li Zhang, Xiaomei Teng, Hui Chen, Ze-Guang Han. Genetic and epigenetic silencing of scavenger receptor SCARA5 as a candidate tumor suppressor could contribute to hepatocellular carcinoma via activation of FAK. J Clin Invest. 2010 Jan;120(1):223-41

4.       Huang J, Zhang X, Zhang M, Zhu JD, Zhang YL, Lin Y, Wang KS, Qi XF, Zhang Q, Liu GZ, Yu J, Cui Y, Yang PY, Wang ZQ, Han ZG. Up-regulation of DLK1 gene could contribute to human hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis. 2007，28（5）：1094–1103.

5.       Jian Huang, Pei Hao, Hui Chen, Wei Hu, Feng Liu & Ze-Guang Han. Genome-wide identification of Schistosoma japonicum microRNAs using a deep-sequencing approach. PLoS One. 2009 Dec 8;4(12):e8206.

6.       Jian Huang, Pei Hao, Yun-li Zhang,Fu-Xing Deng, Qing Deng, Yi Hong, Xiao-Wo Wang, Yun Wang, Peng-Yuan Yang, Xue-Gong Zhang, Yi-Xue Li, Hong-Yang Wang, Ze-Guang Han. Discovering multiplicate transcripts of human hepatocytes using massively parallel signature sequencing (MPSS). BMC Genomics 2007, 8:207 (2 July 2007)

7.       Jian Huang, Yun-Li Zhang, Yun Lin, Da-Li Zheng, Ze-Guang Han. Down-regulation of SFRP1 as a tumor suppressor gene can contribute to human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer 2007, 7:126. (12 July 2007)

8.       Huang J, Sheng HH, Shen T, Hu YJ, Xiao HS, Zhang Q, Zhang QH, Han ZG. Correlation between genomic DNA copy number alterations and transcriptional expression in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. FEBS Letters. 2006 Jun 26; 580(15):3571-3581

9.       Tingting Li; Jian Huang; Ying Jiang; Yan Zeng; Fuchu He, MIchael Zhang, Zeguang Han, Xuegong Zhang. Multi-stage analysis of gene expression and transcription regulation in C57/B6 mouse liver development. Genomics 93 (2009) 235–242.

10.   Yao Yu, Jie Ping，Hui Chen, Longxian Jiao, Siyuan Zheng, Ze-Guang Han，Pei Hao，Jian Huang*. A comparative analysis of liver transcriptome suggests divergent liver function among human, mouse and rat. Genomics. 2010 Nov;96(5):281-289.

11.   Jian Huang*. Current Progress in Epigenetic Research for Hepatocarcinomagenesis. Sci China C Life Sci. 2009 Jan;52(1):31-42.

12.   Jian Huang*, Yun Lin, Lihua Li, Deng Qing, Xiao-Mei Teng, Yun-Li Zhang, Yuanjie Hu, Haihui Sheng, Pengyuan Yang, Ze-guang Han. ARHI, as a novel suppressor of cell growth and down-regulated in human hepatocellular carcinoma, could contribute to hepatocarcinogenesis. Molecular Carcinoma, 2009 Feb;48(2):130-40

13.   Xin Yi, Jingjing Li, Shuang Yu, Ai Peng Zhang,Jiajia Xu, Ji Yi,JingZou, Xifang Nie, Jian Huang, Jian Wang. New MALDI-TOF Mass Spectrometry Method Provides High-Sensitivity, High-Throughout HPV Genotyping. American Journal of Clinical Pathology. 2011 Dec;136(6):913-9.

14.   Xiang-Ru Xu, Jian Huang, Zhi-Gang Xu … Zhu Chen and Ze-Guang Han. Insight into hepatocellular carcinogenesis at transcriptome level by comparing gene expression profiles of hepatocellular carcinoma with those of corresponding noncancerous liver. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98 (26): 15089-15094.