Western Blot实验操作指南优化（中）

　　

Caitlin Smith撰写/张迪编译

生物通报道：Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法，但是要将这种技术变成你的有利手段，并不容易。因此优化实验操作手册至关重要，但是，正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的，“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”，Ryan继续说道，“问题是大多数人都不知道何处需要优化。坦率地说，Western blot检测过程耗时太长。如果每个印迹实验都有花费你两天时间，那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢？”当然，类似抗体质量，封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色，让我们来仔细看看，现今还有哪些优化的技巧和工具。

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考虑下荧光检测

许多研究人员都没能充分利用可获得的全范围标记，Carestream Molecular Imaging公司全球体外产品经理Stephanie Noles说，“从化学发光标记到荧光标记的过渡，可谓艰巨，但它确实开辟了所能研究的类型和数量”，她说，“越来越多的荧光抗体出现，用于蛋白检测。新的染料，抗体，和其它标记都在这样一个快速的速度下成为可能，确实令人想要试一试”。

Carestream Molecular Imaging公司新推出的Gel Logic 6000 PRO imager就是一款不仅在ECL化学发光成像上具有高灵敏度，而且也真正实现近红外双色荧光成像以及多色荧光成像应用的一款仪器。“Gel Logic 6000 PRO能检测到一次印迹中的所有化学标记，和荧光标记，”她说，“这大大扩展了研究范围，因为这将不再需要HRP-型抗体的印迹中常用到的去除和重标记过程”。这一成像仪还可以覆盖荧光和化学发光信号，无需再将印迹移来移去了，这样就能同时检测出更多的蛋白。

精简实验流程

减少WB从开始到结束所需耗费的时间，能令实验过程更加优化。Bio-Rad的V3 Western Workflow（3个V代表着可视化，验证和确认（visualize, verify, and validate））可以以两种方式完成精简。

其中V3 Western Workflow的无染色技术利用的是UV激活复合物，这种复合物包裹在Bio-Rad预制胶中，实现整个WB实验中过程可视化，研究人员可以一直看到蛋白，从而帮助研究人员检查这个过程中不同点上印迹的进程。这也就意味着，无需跑上两块胶，然后用考马斯亮蓝染色其中一个来检测另外一个了，现在可以只跑一个凝胶，简单地将它放入成像仪，进行一分钟UV光成像激活，而且也可以在转印后，成像印迹膜，以及凝胶，来评估转印效率。

“我们正在往这个过程中添加检查点，而不是增加额外的时间”，Short说，“事实上，我们已经实现了加速”。

“传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳大约需要40-60分钟的时间，而采用Bio-Rad公司的凝胶，现在需要15分钟或更少时间。这个TransBlot Turbo Transfer System 还能将转移时间从从一个小时缩短到约3-7分钟”。

“这个更短的操作流程，更容易优化”，他说，“人们都害怕进行更多的优化，因为他们认为这将增加更多的时间。利用这一系统，如果开始不能有好的结果，但很容易优化。研究人员不仅有更多的时间进行优化，而且也有更多的检测点，来评估过程中需要优化的步骤。”

Western优化过程中另一个挑战就是，在检测动态范围内利用高丰度看家蛋白，来测量低表达的蛋白。“通过这一无需染色的技术，而不是看家蛋白的比对，我们能让总蛋白规范化，”Short说，“这是对于利用化学发光检测进行实验的研究人员来说，特别有用，因为他们需要在检测后去除抗体，然而进行重标记，这要花费2-4个小时。而利用这种无染色技术，就省去了这一大步骤。”

Bio-Rad在这个过程中有一个新工具：称为ImageLab4.1的软件，这个软件能比其他的软件工具，以一种更直观的方式，自动完成这个blot normalization过程。“而不是手动绘制看家蛋白对照表格，Image Lab 能分析每条蛋白道，计算出总蛋白量来”Short说,“然后利用运算方法检测兴趣蛋白，并自动计算出规范密度值。”

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