鉴别DNA甲基化，总有一款工具适合你

一谈到真核遗传，众所周知基因组仅仅是个起点，目前表观基因组的研究正是炙手可热。自2009年以来，表观遗传学修饰已使遗传字母表扩充到了八个成员A、C、G、T、5-mC、5-hmC、5-fC和5-caC。除了标准甲基化形式5-mC，其他甲基化类型也逐渐成为研究热点。这几种甲基化修饰就像亲兄弟，要准确分辨它们可并不容易，本文就为您初步总结了几种甲基化识别方法和工具。

一谈到真核遗传，众所周知基因组仅仅是个起点，此外还有表观基因组，这种可遗传的DNA和组蛋白化学修饰控制着基因组的表达。

5-mC和5-hmc

DNA甲基化就是这类化学修饰中的一员，甲基化一般发生在哺乳动物基因组CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基（5-甲基胞嘧啶/5-mC），主要集中于CpG岛和基因调控元件，与基因沉默有关。

其实人们早在几十年前就发现了DNA甲基化现象，5-甲基胞嘧啶还被称为DNA的“第五种碱基”，表观遗传学研究者们开发了大量的分子工具来追踪和分析它。然而在2009年，两组研究团队（洛克菲勒大学Nathaniel Heintz团队和哈佛医学院Anjana Rao团队）同时在Nature杂志上发表了重要文章，他们发现了另一种甲基化修饰形式——5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，这无异于在生物学界投下一枚重磅炸弹。

“自2009年以来最大的变化可能就是，现在大家的研究主要集中在这些DNA甲基化变体上，”Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp说，Active Motif公司是一家以“促进表观遗传学研究”为宗旨的美国知名公司。

在上述两篇文章中，研究人员分别在小鼠Purkinje神经元和胚胎干细胞中发现了5-hmC，5-hmC与5-mC在细胞和基因组中的分布不同，5-hmC主要集中在基因片段中。TET蛋白家族的酶对5-mC进行修饰形成了5-hmC。然而，许多传统DNA甲基化研究方法都无法分辨这两种类型的修饰，默克密理博的表观遗传学产品经理Michael Sturges说，这意味着人们需要重新审视过去几十年的一些甲基化分析。

“这说明在过去15至20年间，人们收集到的数据在一定程度上包括了羟甲基胞嘧啶事件，”Sturges的同事，默克密理博的表观遗传学研发经理John Rosenfeld说。

5-fC和5-caC

不过，遗传学字母表中可不止这六个成员，除了A、C、G、T、5-mC和5-hmC，至少还存在两种甲基化修饰类型。DNA甲基转移酶负责对真核生物的胞嘧啶残基进行甲基化。Tet1能够将5-mC转化为5-hmC，但这种酶并未就此罢手，它能够进一步将5-hmC氧化成为5-甲酰胞嘧啶(5-fC)，甚至再转化成为5-羧基胞嘧啶 (5-caC)，这一酶促通路似乎参与了去除DNA 5-mC标志的过程，Rosenfeld说。（该通路的更多信息，请参阅Active Motif的DNA甲基化指引手册。）

研究以上各种甲基化类型的方法之一就是亲和捕获。标准5-甲基胞嘧啶的传统研究方法是甲基化DNA免疫沉淀MeDIP和MIRA（methylated CpG island recovery assay），这两种方法分别利用抗5-mC的抗体和甲基化DNA结合蛋白 (MBD)来捕获被修饰的DNA片段。而现在，研究人员也同样能够使用特异性抗体对5-hmC进行研究。

目前包括默克密理博在内的许多公司都提供抗5-hmC的抗体，Active Motif当然也不例外。Active Motif将这种抗体打包在hMeDIP（羟甲基化DNA免疫沉淀）试剂盒中，用来捕获包含甲基化修饰的DNA序列。除此以外，研究者们还可以使用该公司新品Hydroxymethyl Collector™试剂盒来富集含5-hmC的DNA片段。（Active Motif也为那些对5-fC或者5-caC的研究者们提供了相应抗体。）

“Hydroxymethyl Collector是我们去年发布的最引人注目的技术，”Hondorp说。

Active Motif公司的MethylCollector Ultra™ 试剂盒是利用MBD2b和MBD3L1来纯化甲基化的DNA。而Hydroxymethyl Collector试剂盒则不同，它利用了一种酶——beta-葡萄糖基转移酶（Millipore也有相应产品提供），这种酶能够特异性的使5-hmC糖基化。这种被转移的葡萄糖基是经历过叠氮化合物修饰的，它能与生物素相连，使得Hydroxymethyl Collector试剂盒中的链霉亲和素磁珠能够捕获含5-hmC的DNA片段。

使用hMeDIP和Hydroxymethyl Collector试剂盒得到的都是是DNA片段的混合物，其中每条片段中都至少含有一个5-hmC修饰。研究人员可以对这一混合物进行测序来得到整个基因组的羟甲基化信息，或者也可以通过PCR进行逐个位点的分析。当然这种混合产物还可以用于芯片分析。专门针对甲基化研究的芯片包括：美国安捷伦科技公司的DNA Methylation Human CpG Island芯片和Illumina公司的Infinium® HumanMethylation450 BeadChip等。罗氏NimbleGen也有一款包括10个芯片的Human DNA Methylation 2.1M Whole-Genome Tiling芯片组合，不过据罗氏应用科学公司的市场部经理Clotilde Teiling称，由于NimbleGen准备将重心从芯片领域转到序列捕获产品，该芯片产品将于今年年底停产。

New England Biolab公司的EpiMark® 5-hmC and 5-mC analysis 试剂盒也是同样利用beta-葡萄糖基转移酶对5-hmC进行糖基化。不过，这一试剂盒是根据糖基化后5-hmC和5-mC对限制性内切酶的敏感性不同来进行区分，未糖基化的甲基化位点含有对MspI(5'-C / CGG-3')敏感的序列，而糖基化的序列则对MspI酶不敏感。

此外还有一种特异性识别5-hmC的酶，限制性内切酶PvuRts1I，这种酶Active Motif也有提供。PvuRts1I与含5-hmC的DNA结合，在相应核苷酸位点（9和13）对双链进行切割，得到含5-hmC的24bp片段。用这种酶处理基因组DNA就会得到上述片段的混合物，对这种片段混合物进行测序的效果与MeDIP测序相同，都能够揭示基因组范围的5-hmC位点。

重亚硫酸盐测序

为了达到准确的bp级分辨率，研究人员还需要采取特殊策略。重亚硫酸盐测序是公认的甲基化DNA测序“金标准”。用亚硫酸氢钠处理DNA能够将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在DNA测序反应中最后显示为胸腺嘧啶。将该数据与未处理的DNA测序数据相比对就能够确定甲基化的位点。

然而，与其他一些甲基化分析方法一样，重亚硫酸盐也无法区分5-mC和5-hmC。不过今年早些时候，研究者们提出了解决这一难题的两种方法。

其一是Tet辅助的重亚硫酸盐测序TAB-Seq，这种方法利用TET蛋白的活性将5-mC氧化为5-caC。在用亚硫酸氢钠处理时，5-caC就像未修饰的胞嘧啶一样被转化为尿嘧啶。该方法先用beta-葡萄糖基转移酶将5-hmC糖基化保护起来。随后用TET处理DNA，使其他甲基化胞嘧啶转变为5-caC。最后再用重亚硫酸盐处理DNA。在测序过程中，所有胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶都被读为T，而5-hmC仍然为C。将这一数据与标准重亚硫酸盐测序生成的数据相比，就能使研究人员确定哪个碱基包含何种修饰。位于芝加哥的WiseGene公司已经成功将这一技术商业化。

另一种方法是氧化重亚硫酸盐测序（oxBS-Seq），用高钌酸钾将5-hmC氧化为5-fC。在用重亚硫酸盐处理后，5-fC（就像胞嘧啶）测序读取为T。同理，将标准重亚硫酸盐处理的DNA序列与oxBS-Seq DNA序列相比对就能够区分5-mC与5-hmC。

当然，供应商们并没有忽略5-甲基胞嘧啶。用Sturges的话说，重亚硫酸盐转化是“出了名的繁琐”，需要研究人员把握好试剂、时间和温度的平衡，才能将胞嘧啶完全转化而又不影响到甲基化胞嘧啶。为此，默克密理博发布了增强版的重亚硫酸盐转化试剂盒，CpGenome Turbo Bisulfite Kit。

据Sturges介绍Turbo kit物如其名，该试剂盒采用新化学物质和优化的反应温度，将重亚硫酸盐16小时的标准转化流程缩短到了90分钟。在内部测试中，这一试剂盒的转化效率达到了99.9%，并且丝毫没有发生过度转化。

定向选择甲基化DNA

默克密理博公司还发布了可与Turbo kit配套使用的甲基化DNA富集试剂盒CpG MethylQuest。这种试剂盒用MBD2特异性捕获含5-甲基胞嘧啶的DNA，并且能够控制所收集的产物中不含未修饰的碱基或者5-hmC。

安捷伦科技公司也为甲基化DNA的二代测序提供了一款目标富集产品，SureSelect XT Human Methyl-Seq kit试剂盒。该公司基因组学业务部市场副总监Yong Yi介绍，与用于目标外显子测序的SureSelect exome kit类似，该试剂盒能够有效减少目标区域的测序成本和测序时间。

“人类全基因组测序成本高耗时长，令不少研究者望而却步，相比之下外显子测序的效率就高多了，”Yi说。“我们将这一理念应用于Methyl-Seq试剂盒，使Methyl-Seq实验更有针对性。”

该试剂盒包含120-mer RNA饵，用于捕获人类基因组CpG岛、以及“shores”“ shelves”区域中的甲基化片段。（Shores和shelves分别是指距CpG岛边缘2kb和4kb的区域，在这些区域中发现了许多差异性甲基化的序列，Yi说。）该试剂盒总共能够捕获3.7百万CpG超过84Mb序列。而安捷伦的methylation-focused DNA芯片是覆盖整个基因组的27,800 CpG岛。 “这是相当复杂而全面的设计，”Yi说。

罗氏NimbleGen不提供现成的DNA甲基化目标富集产品，但用户可以量体裁衣自行设计，公司能够为客户将2.1百万的探针混合在单个小管中，Teiling说。

当然，随着表观遗传学越来越重要，扩展到的领域越来越多，也许您会被这些五花八门的技术和方案弄得有些无所适从。不用担心，自有公司能为您提供贴心又省心的服务，这些公司的专业人员提供的技术服务，能为您免去了大量的优化工作，节省宝贵的时间和精力。举例来说，Active Motif公司最近收购了GenPathway，这意味着该公司现在能够提供诸如重亚硫酸盐测序、生物信息学分析、hMeDIP等技术服务。“现在我们能够为无法自己进行这类实验和数据分析的客户提供帮助。”Hondorp说。

（生物通编辑：叶予）

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参考文献：

1 S. Kriaucionis, N. Heintz, “The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons in the brain,” Science, 324:929¬–30, 2009.

2 M. Tahiliani et al., “Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydromethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1,” Science, 324:930–5, 2009.

3 http://www.activemotif.com/documents/1654.pdf

4 H. Wang et al., “Comparative characterization of the PvuRts1I family of restriction enzymes and their application in mapping genomic 5-hydroxymethylcytosine,” Nucleic Acids Res, 39:9294–9305, 2011.

5 M. Yu et al., “Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome,” Cell, 149:1368–80, 2012.

6 M.J. Booth et al., “Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution,” Science, 336:934–7, 2012.