最新综述：超越5种碱基的DNA测序（三）

迄今为止的DNA测序研究大多集中在分析四种标准碱基和5-甲基胞嘧啶。研究显示核苷酸的许多其他化学修饰也控制着基本生命功能，而这些修饰不能通过传统测序方法进行检测。发表在Current Opinion in Structural Biology杂志上的这篇综述着重介绍了一些新兴的具有直接检测多种DNA碱基修饰类型潜力的单分子测序技术。

纳米孔单分子测序
   在纳米孔单分子测序技术中，相关纳米孔直径只允许严格线性序列的单链DNA通过。纳米孔可以是生物源的，如a-溶血素 (aHL) 或MspA蛋白等膜蛋白复合体。也可以由固体材料合成，如氮化硅、氧化铝、多层石墨烯三明治、单层石墨烯或者碳纳米管。纳米孔包括一个能区分不同碱基的检测区域，在碱基穿过纳米孔时生成相应的短暂信号。随后对不同类型的信号进行评估，包括穿过纳米孔的电流阻塞、跨越纳米孔的隧道电流或者电容改变。

   研究显示，该技术能通过电流信号在固定于aHL 纳米孔、MspA孔或穿过氮化硅纳米孔的单链DNA片段中对5-mC和5-hmC进行区分（图4）。该技术成功的关键是对DNA穿孔转运的精确控制，在一些研究项目中科学家利用了酶活性来辅助这一技术，如将核酸外切酶或聚合酶放置在纳米孔入口附近。研究显示，使用共价结合了环糊精分子作为检测读取头部的aHL纳米孔，结合核酸外切酶，通过检测残基的纳米孔电流，能够从自由核苷酸磷酸盐单体形式的四种标准碱基中区分5-mC。有文章显示，该技术结合聚合酶，通过检测DNA复制时模板链穿过纳米孔产生的电流阻塞差异，能实时监测DNA聚合酶连续添加核苷酸的过程。由于该技术是基于对DNA聚合酶的连续活性进行单分子实时监测来进行测序，可想而知也可以通过与SMRT测序分析聚合酶动力学相同的方式对碱基修饰进行检测。为了通过单独监测每个纳米孔电信号获得大量多重分析信息，有文章报道了一种可供选择的方案，能对多个纳米孔进行平行的光学读取，但这需要将目标DNA序列的每一个核苷酸进行转化标记上分子信标，而这种样品制备方法难以应用于检测碱基修饰。

图4：纳米孔测序检测5-mC和5-hmC。通过残基孔电流差异检测到了胞嘧啶的修饰。来自参考资料.

显微镜单分子测序

    有研究应用先进的电子显微镜技术以单碱基的空间分辨率，对DNA模板分子的遗传和表观遗传学信息进行直接读取。包括利用透射电镜（TEM）直接对能唯一地区分不同碱基的原子进行化学检测。以及用碘和溴等化合物对碱基进行化学标记，以增强检测能力和对比度。可以想见在未来，能利用显微镜直接成像或碱基修饰特异性化学转化技术对特定碱基修饰进行检测，如用含可检测原子的葡萄糖标记5-hmC或带可检测链的叠氮葡萄糖标记（类似方法见）。

    显微镜方法成功的一个先决条件是将各DNA分子结合到可靠的基底上。近来有研究将DNA分子转印到单层石墨烯上（被认为是高分辨率电镜的最佳基底），通过高分辨率电子束照射和电子能量损失谱分析，成功应用了使这项技术。这种方法随后被用于检测5-mC在DNA分子上的分布，该研究依据荧光标记的methyl-CpG结合多肽的结合情况，能对不同甲基化水平的DNA分子进行比较，该方法目前只用于宽场荧光检测。该文章显示该方法也能适用于超高分辨率光学显微镜或电子显微镜技术，以增强空间分辨率。

    还有研究报道了使用扫描隧道显微镜（STM）对单链DNA分子进行成像，通过分析STM 原子针尖、碱基和导电表面之间隧道电流的差异检测四种碱基。科学家利用该技术得到了已知序列的单链DNA分子中的鸟嘌呤“电子指纹”。未来，可能通过这种方法得到其他碱基修饰的电子指纹。

RNA直接测序       

    人们在RNA分子中发现了更大量的碱基修饰。这些修饰是决定重要代谢过程的结构和调控所必须的，且与疾病发展相关。曾今由于缺少常规高通量的RNA直接测序技术，要在测序水平上进行RNA修饰研究很困难。而繁重非测序分析方法往往缺乏足够的分辨率，大大限制了RNA碱基修饰研究。重亚硫酸盐处理也被用于在RNA研究中检测RNA5-mC甲基化模式。在cDNA合成过程中，特定RNA碱基修饰会引起互补cDNA链的碱基改变（如：腺嘌呤-肌苷修饰，肌苷在体外反转录中被识别为鸟嘌呤），因此能通过比较cDNA序列和同源基因组序列就能对RNA碱基修饰进行推断。

    有研究描述了基于Helicos方法的RNA直接测序short-read技术，但与DNA测序情况类似，该方法难以应用于检测RNA碱基修饰。在最近的文章中，通过用一个逆转录酶代替DNA聚合酶，研究人员应用SMRT测序直接读取RNA模板信息，在合成RNA模板和转染了报告系统的细胞RNA中成功检测了6-mA。

结论

    DNA测序对我们的生物学知识进行了革新，从根本上改变了生物学的研究方式。通过强大的计算方法将广泛且高效的DNA和cDNA测序，与蛋白质组学、生物分子动力学和大量其他表型信息结合起来，能使生物学研究形成彻底转变，从而改善人类健康、提高食品和能源供给和加强环境保护。然而迄今为止，测序研究还主要集中在四种标准碱基和5-mC上，而这些研究所提供的DNA结构信息明显不足。研究显示大量核苷酸修饰在多种重要生物学过程中起着决定性作用，包括基因表达、免疫力、疾病和致病性。此外，根据近期新碱基修饰的发现速率推断，很可能功能性相关的DNA化学修饰还没有完全被发现。

    因此就需要加快开发高通量的自动化测序新技术，以分析A, C, G, T和 5-mC以外的DNA信息，揭示DNA的全部结构和功能复杂性。在一些新兴测序方法的帮助下，我们将步入揭示广泛表观遗传学信息的测序革命下一阶段。

生物通推荐原文：

Going Beyond Five Bases in DNA Sequencing

通讯作者：Korlach, Jonas ([e-mail]) and Turner, Stephen W ([e-mail])

文献：

Clark et al, Direct Detection and Sequencing of Damaged DNA Bases (2011)<http://www.genomeintegrity.com/content/2/1/10>

  *   Clarket. al. Characterization of DNA methyltransferase specificities using single-molecule, real-time DNA sequencing, Nucl. Acids Res. (2011)<http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2011/12/07/nar.gkr1146.full>

  *   Song et al. Sensitive and Specific Single-Molecule Sequencing of 5-Hydroxymethylcytosine, Nature Methods<http://www.nature.com/nmeth/journal/vaop/ncurrent/full/nmeth.1779.html>

  *   Flusberg et al. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing, Nature Methods 7, 461–465<http://www.nature.com/nmeth/journal/v7/n6/full/nmeth.1459.html>

视频：

E．coli O104甲基化分析

http://aa314.o1.gondor.io/webinar/uncovering-novel-regulatory-mechanisms-via-a-more-complete-characterization-of-dna-variation/

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