最新综述：超越5种碱基的DNA测序（二）

迄今为止的DNA测序研究大多集中在分析四种标准碱基和5-甲基胞嘧啶。研究显示核苷酸的许多其他化学修饰也控制着基本生命功能，而这些修饰不能通过传统测序方法进行检测。发表在Current Opinion in Structural Biology杂志上的这篇综述着重介绍了一些新兴的具有直接检测多种DNA碱基修饰类型潜力的单分子测序技术。

通过整体测序检测DNA修饰

    研究显示自动化末端染色的Sanger测序方法能检测常见的三种细菌表观遗传学标记4-mC, 5-mC和6-mA。DNA模板中的甲基会影响双脱氧终止法的核苷酸编入，与无修饰的对照DNA样品数据比较时，会引起荧光示踪色谱图的峰值变化。当模板含6-mA时T信号较高，含5-mC时G信号较低，而含4-mC时G信号较高，以此可以区分不同的胞嘧啶修饰形式。该方法已用于检测幽门螺杆菌、E. coli和脑膜炎奈瑟氏菌中的甲基转移酶。不过就我们所知，这一方法并没有广泛应用于细菌基因组甲基化检测。可能是由于该方法得到的信号量级较小，且Sanger测序本身通量相对较低。我们也没有发现应用这种方法检测其他DNA碱基修饰的尝试。

    第二代DNA测序技术依赖样品制备阶段的DNA扩增，这会造成碱基修饰的损失，并且阻碍了测序手段在检测碱基修饰上的应用。因此，碱基修饰位点研究主要集中在应用各种样品前处理技术，间接推测碱基修饰的存在。通过重亚硫酸盐测序，第二代测序被广泛用于检测5-mC的丰度和动态调控。此外有文献描述了一种应用MspJI家族限制性内切酶的方法。这种酶识别DNA中的5-mC或5- hmC，并在碱基修饰的上游12个碱基和下游16个碱基处切割一个短DNA片段。提取这些片段进行第二代测序，就能确定基因组中碱基修饰的位点。这种酶对于胞嘧啶修饰侧面的不同碱基有偏好，因此在建立全基因组修饰图谱时会造成偏颇。重亚硫酸盐和MspJI介导的测序目前都无法区分5-mC 和5-hmC。

    科学家为了检测其他碱基修饰，采用了针对特定修饰的富集方法。Pull-down方法利用抗体或修饰特异性结合蛋白选择性富集含碱基修饰的DNA片段，并进行高通量的DNA第二代测序，在测序片段上至少存在一个碱基修饰就能被检测到。然而，这种方法并不能得到确切修饰位点和哪条DNA链被修饰的信息。有文献描述了5-hmC DNA的不同富集方法，以及用于检测碱基J在基因组分布的anti-J抗体富集方法。

检测DNA修饰的新兴测序方法

    将DNA测序灵敏度推至分析极限，并能得到单个DNA分子序列的新技术引起了科学家的广泛兴趣。开发这种新技术的动力之一，就是希望应用测序技术读取DNA碱基修饰信息。研究人员已采用了多种不同技术进行这方面的研究，有些技术已经商业化。

Gated single-molecule sequencing-by-synthesis

    Helicos Biosciences的商业化技术采用在第二代测序基础上产生的gated sequencing-by-synthesis进行单分子测序。该技术结合DNA聚合酶和荧光标记技术，单独的DNA分子在一次一个碱基的延伸过程中能同时被检测到，检测步骤后末端基团被移除。该技术并不需要目标DNA的扩增，测序的成功依赖于在成像前DNA链上核苷酸的完全编入，所以可能难以找到一种方法能使该技术直接对DNA模板中的碱基修饰敏感。有文献报道科学家结合一种5-hmC特异性富集方法，应用该技术对胚胎干细胞中5-hmC DNA片段成功进行了全基因组作图。不过很可惜，Helicos Biosciences目前面临关闭，能否过关尚未可知。

单分子实时DNA测序

    Pacific Biosciences商业化的单分子实时（SMRT1）DNA测序技术是目前唯一市面商品化的单分子测序系统，通过持续监视DNA聚合酶活性进行测序。该技术应用末端带有荧光标记的核苷酸，能实现DNA的连续合成，不再需要washing和gating步骤。作为测序过程的一部分，详细的DNA合成动态以一列荧光脉冲的形式被记录下来。研究者发现聚合酶的动力学会受到DNA模板中修饰碱基的影响。将天然DNA与无修饰的对照模板进行比较，以聚合酶活性部位保持核苷酸结合的时间（脉冲宽度, PW）和核苷酸成功结合状态间的时间间隔（脉冲间隔时间, IPD）作为主要指标，可以检测含碱基修饰的模板是否改变了聚合酶的动力学特征。IPD可能受到两种因素的影响：(i)新结合核苷酸的亲和力改变，或者(ii)标记核苷酸编入引起的DNA移位速度改变。因素(i)对酶构象改变率的影响，和因素(ii)对核苷酸编入循环的催化率的影响都会导致PW的改变，模板中的碱基修饰会扭曲活性位点的构象。由于SMRT测序实时监测每个核苷酸的编入情况，上述影响都能被该技术捕捉到。这种技术对于5-mC等较小化学修饰引起的微小变化也很敏感。

    SMRT测序能对天然未扩增的DNA进行测序，可以直接检测DNA碱基修饰。由于SMRT测序的标准模板制备会形成一个闭合环状DNA分子，能对同一个碱基修饰进行多次研究，增加了检测的统计学效力。该技术还能在同一测序读段中对DNA分子的两条链进行测序，直接分析指定位点的正反义链修饰间可能存在的关系。（例如，CpG位点的完全甲基化）

    在应用SMRT测序直接检测了5-mC, 5-hmC 和6-mA之后，这项技术随后被应用于三个领域。首先是结合5- hmC特异性富集方法和SMRT测序对5-hmC进行选择性标记和测序。富集方案的一部分是为5-hmC添加化学集团，增强动力学信号，在单DNA分子水平上对5-hmC 的修饰位点和修饰的链特异性进行检测。该方法在合成DNA样品和小鼠胚胎干细胞DNA样品中都得到了成功应用。

    随后科学家成功应用SMRT测序确定了16种甲基转移酶的识别序列，包括了全部三种普遍存在的原核表观遗传修饰形4-mC, 5-mC和6-mA，还包括了此前未知序列特异性的三种甲基转移酶（图3）。对于特定甲基转移酶（包括E. coli的Dam甲基转移酶），研究观察到了出人意料的混乱，它们使与源序列相近但并不完全相同的位点甲基化。

    SMRT测序还被应用于描绘DNA损伤产物的动力学特征，包括8-羰基鸟嘌呤、8-羰基腺嘌呤, O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶, 5羟甲基尿嘧啶和胸腺嘧啶二聚体。研究显示该技术能方便的对这些碱基修饰的位点和链特异性进行检测。研究者在合成模板中对上述DNA碱基修饰生成的独特动力学特征进行了研究，但该技术还未被用于在生物学样本中检测受损DNA碱基。

   上述动力学影响并不限于只影响有化学修饰的核苷酸，而是影响了相关修饰核苷酸周围的区域，即修饰位点约前三个核苷酸和后七个核苷酸。该区域的动力学信号量级依赖于碱基修饰的化学类型和序列本身。这些动力学影响会使聚合酶与DNA模板和初生双链DNA的结合扩大11个碱基。有文献描述了在发生编入错误时，错配通过DNA长程扭曲被传送回酶活性位点的现象。与此相似的是，扩展的DNA结合区域的碱基修饰会引起DNA构象扭曲，影响聚合酶活性位点的核苷酸编入动力学，造成额外信号，形成指定DNA碱基修饰的独特动力学特征。特异性DNA–protein互作和邻近序列效应还有待更详细的分析，而这些动力学特征已可用于区分不同的碱基化学修饰。对上述影响的广泛分析被用于区分具有相似特征的碱基修饰（如6-mA and 1-mA），以及分辨位置非常接近的碱基修饰。对于那些动力学影响相对较小的修饰（如5-mC），目前推荐使用更高的测序覆盖度倍数进行置信度评价，并且需要开发能生成更强动力学信号的酶。

图3：SMRT测序鉴定DNA甲基化。通过SMRT测序分析聚合酶动力学，对天然DNA样品和无修饰的对照序列进行比较，检测甲基转移酶催化的碱基甲基化。如图显示甲基转移酶M.EsaLHCI催化DNA序列的50-GATC-30处4-mC甲基化。编自参考资料。

最新综述：超越5种碱基的DNA测序（一）    

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