最新综述：超越5种碱基的DNA测序（一）

迄今为止的DNA测序研究大多集中在分析四种标准碱基和5-甲基胞嘧啶。研究显示核苷酸的许多其他化学修饰也控制着基本生命功能，而这些修饰不能通过传统测序方法进行检测。发表在Current Opinion in Structural Biology杂志上的这篇综述着重介绍了一些新兴的具有直接检测多种DNA碱基修饰类型潜力的单分子测序技术。

    DNA测序已经为科学家提供了丰富的关于生物系统的信息，不过迄今为止的研究大多集中在对基因组DNA序列和重亚硫酸盐处理后的碱基序列进行比较，分析四种标准碱基和5-甲基胞嘧啶。研究显示核苷酸的许多其他化学修饰也控制着基本生命功能，能影响病原体毒力，并与多种疾病相关。而这些修饰不能通过传统测序方法进行检测。在此背景下，本综述着重介绍了一些新兴的具有直接检测多种DNA碱基修饰类型潜力的单分子测序技术，文章发表在Current Opinion in Structural Biology杂志上。

简介

    基因组和转录组的碱基排列决定了所有生物的遗传蓝图和细胞特征，因此核酸测序是研究生物系统最重要的技术之一。二十世纪六十年代末期科学家实现了在群体中对同一DNA分子的4种标准碱基序列进行解码，并且通过Sanger测序发展了一种高通量的自动化技术。随后，第二代测序技术以更低的成本提供了更高的DNA测序通量，尽管该技术以牺牲读长为代价。最近新兴的单分子测序方法，有望为科学家提供极长的DNA测序读段，更快的测序速度，更少的测序前处理步骤，和更强的分析复杂异构DNA混合物的能力。

    DNA除了携带基本遗传信息以外，还含有表观遗传学修饰信息。表观遗传修饰现象出现在包括病毒和噬菌体的几乎所有生物体内。这种修饰随着空间（生物体不同组织和细胞类型）和时间（生物体生命周期的不同阶段）的不同而变化，大大扩展了DNA的结构复杂性和信息含量。在高等真核生物中，最常见的表观遗传标记是5-甲基胞嘧啶(5- mC)，5- mC 是DNA 复制后DNA甲基转移酶催化产生的。5-mC能影响基因表达、基因组印迹、转座因子抑制和X染色体失活，是生长和发育所必须的，并且涉及多种疾病（包括自闭症和结肠癌）。5-mC测序通常要经重亚硫酸盐的化学处理，将所有胞嘧啶残基转化为尿嘧啶只留下5-mC不变，随后对DNA产物进行扩增将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶T。已有多篇文章对该方法和其他基于芯片的非测序方法进行了综述。也有文献对不同重亚硫酸盐方法的优劣进行了详细比较。

    虽然针对基因组中4种标准碱基以及5-mC（通过重亚硫酸盐测序）的测序技术不断进步，在速度和效率上不断增加，成效显著，但是对DNA其他重要化学修饰形式进行测序检测的方法却发展得格外缓慢。在此背景下，我们总结了现有的DNA化学修饰知识，回顾了获得这些信息的方法技术，并着重强调了能检测DNA碱基修饰的新兴测序方法。

目前的DNA修饰谱

图1：DNA修饰谱，化学键修饰用红色表示。缩写对应：6-mA：N6-甲基腺嘌呤；5-mC：5-甲基胞嘧啶；5-hmC：5-羟甲基胞嘧啶；5-fC：5-甲酰胞嘧啶；5-caC：5-羧基胞嘧啶；U：尿嘧啶； base J：b-D-吡喃葡萄糖氧甲基尿嘧啶；4-mC：4-甲基胞嘧啶；PT：硫代磷酸核苷酸；8-oxoA：8-氧桥腺嘌呤；1-mA：1-甲基腺嘌呤；5-hC：5-羟基胞嘧啶；3-mC: 3-甲基胞嘧啶；8-oxoG: 8-氧桥鸟嘌呤；O6-mG：O6-甲基鸟嘌呤；N2-BPDE-G：二羟环氧苯并芘；5-hU：5-羟基尿嘧啶；5- hmU：5-羟甲基尿嘧啶；O4-mT：O4-甲基胸腺嘧啶；rN：核糖核苷酸

 

 

    DNA有很多种重要的功能性修饰（图1）。除了5-mC以外，在多种哺乳动物细胞中还检测到了5- mC被Tet酶家族氧化形成的5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC)，且5-hmC与胚胎干细胞分化、细胞发育和致癌作用相关。重亚硫酸盐处理方法能检测5-hmC，但不能将其与5-mC区分开。最近在小鼠胚胎干细胞和器官中发现了5-甲酰胞嘧啶 (5- fC),和5-羧基胞嘧啶 (5-caC)，这使胞嘧啶的化学修饰形态总数增加为4种，并且引发了人们对是否还存在其他胞嘧啶表观遗传学形态的兴趣。另有研究发现在原生生物、植物和蚊子中存在N6-甲基腺嘌呤(6-mA)，有间接证据显示6-mA在哺乳动物中也可能存在。研究人员在特定细胞类型中发现了一些影响特定功能的碱基修饰，如尿嘧啶在先天免疫和适应性免疫中起重要作用，β-D-吡喃葡萄糖氧甲基尿嘧啶（base J)在某些寄生原生动物（如锥虫）中影响基因调控和端粒功能，核糖核苷在酵母细胞周期中印记酵母交配型转换。

    DNA修饰在原核生物中也广泛存在。细菌的已知表观遗传学修饰大多数是限制性内切酶目标序列的甲基化，作为细菌DNA抵御病原体入侵的识别标志。这种限制修饰系统的三种最普遍的碱基修饰是，4-甲基胞嘧啶 (4-mC), 5-mC和6-mA，但也存在其他类型的修饰如硫替代磷酸盐的非桥接氧形成的硫代磷酸修饰。最近几年，研究人员发现的限制修饰系统数量增长的很快（图2）。DNA腺嘌呤甲基转移酶（Dam）形成的6-mA，能调控细胞周期和DNA复制、复制后错配修复、基因表达调控、相变转换phase variation switching和致病性等基本细胞功能。在E. coli中DNA胞嘧啶甲基转移酶（Dcm）催化的5-mC会降低稳定期核糖体蛋白基因的表达。

    除了酶促反应介导的有益碱基修饰，DNA损伤也能造成DNA改变。DNA在内源和外源因素造成的持续压力下，碱基的化学稳定性有限，在氧化、烷基化、辐射损伤和水解等不同类型损伤的情况下，DNA容易受到化学修饰。这些DNA损伤造成的DNA碱基修饰在生物体内广泛存在，并对生理状态和疾病表现有重要影响。例如，氧化损伤的产物，如8-羰基腺嘌呤和8-羟基鸟嘌呤（这两种氧化产物在线粒体中尤为广泛存在）与衰老和阿尔茨海默症、帕金森症等神经退行性疾病相关。有害的烷基转移（如1-甲基腺嘌呤、3-甲基胞嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、或O4-甲基胸腺嘧啶）与胶质瘤和结肠癌有关，不过也能应用于化疗中摧毁癌细胞DNA。吸烟、工业化学物或紫外照射等环境因素能导致形成二羟环氧苯并芘（BPDE）和嘧啶二聚体等大化合物，诱发肺癌和皮肤癌。电离辐射也能造成DNA碱基损伤（如5-羟基胞嘧啶、 5-羟尿嘧啶、5-羟基胸腺嘧啶或胸腺嘧啶乙二醇），通过有害自由基生成的直接或间接影响，导致慢性炎症、前列腺癌、乳腺癌和结肠癌。尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和胸腺嘧啶（通过5-mC脱氨基）等的脱氨基产物，具有致突变作用并且能导致多种癌症。基因组DNA在复制过程中整合入核糖核苷酸的损伤类型在酵母中高达0.1%，并与基因组不稳定性有关。

       5-mC以外的碱基修饰检测技术大多局限于大型研究方法，如色谱分析、质谱分析、电化学方法、放射性标记和免疫化学分析，或者对限制性内切酶敏感。这些方法一般缺乏确定碱基修饰确切位点和链特异性所必须的分辨率。因此急需能直接检测碱基修饰的测序方法。

图2：限制修饰（R-M）系统进入REBASE数据库的历史，白色柱表示生化或遗传学鉴定的系统，而黑色柱显示生物信息学序列分析推测的潜在R-M系统。编自参考资料。

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