5-hmC的研究工具盘点[选购宝典]

2011年至今，5-hmC已有多篇文章发表，怎一个火字了得！相信在未来几年又会引发一个新的研究热潮。若要了解5-hmC的功能，研究人员首先需要定位并追踪这种修饰，以便了解它如何随着细胞的改变而改变。除了5-hmC的抗体，文献报道了哪些研究方法？而各大公司又推出了哪些产品呢？

甲基化的火红也就是最近几年的事情。翻开当年的遗传学课本，介绍甲基化的部分还不到一页，寥寥数语，一笔带过。其中也只是谈到了5-甲基胞嘧啶（5-mC），压根没提我们今天的主角5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。5-hmC作为一种DNA甲基化修饰，通过TET家族的酶对5-mC的氧化而产生。有人将5-mC成为第五种碱基，那么5-hmC就是第六种了。

   
       
5-mC & 5-hmC（图片来自Active Motif）

也许有人认为5-hmC是最近发现的，其实不然。早在1952年，科学家们就在噬菌体中发现了这种修饰，当时的那篇文章还是发表在《Nature》上的。几十年来，关于羟甲基胞嘧啶的研究就一直围绕着它对于噬菌体DNA的保护作用。直到三年前，研究人员在人和小鼠的大脑以及胚胎干细胞中发现它们，才将其与基因表达调控联系起来。

2009年5月15日的《Science》杂志同期发表了两篇关于5-hmC的论文。哈佛医学院和免疫疾病研究所的Tahiliani等借助计算机搜索能修饰5-mC的酶，发现了TET1蛋白，并发现TET1的过表达会导致5-mC的减少1。利用薄层层析（TLC）对小鼠胚胎干细胞的基因组DNA进行分析，Tahiliani及其同事发现了另一种经过修饰的胞嘧啶核苷酸。利用质谱仪，他们发现这就是5-hmC。TET1催化了5-mC向5-hmC的转化，而TET1被knockdown之后，5-hmC的水平下降，这表明TET蛋白可能在表观遗传学调控中发挥重要作用。

在另一篇文章中，霍华德•休斯医学研究所的Krisaucionis等也发现5-hmC存在于Purkinje神经元和大脑中2。通过比较5-mC在Purkinje和颗粒细胞核酸中的丰度，他们检测到一种不同寻常的核苷酸。利用薄层层析、高压液相色谱和质谱仪，他们鉴定出5-hmC。在Purkinje细胞中，5-hmC大约占了总核苷酸的0.6%，在颗粒细胞中占0.2%，但不存在于癌症细胞系中。

这两篇文章也被《Nature》杂志评为2009年度论文。尽管5-hmC的确切功能仍不清楚，但普遍认为它参与了DNA去甲基化或基因表达调控。在测序已经不是难题的今天，基因的表达调控更是大家关注的热点。早年被忽略的小分子RNA已经引发了10年研究热潮，而如今，尚处于未知状态的5-hmC在表达调控领域到底有何作用？是否是去甲基化的中间状态？这还有待大家的研究。2011年至今已有多篇文章发表，怎一个火字了得！相信在未来几年又会引发一个新的研究热潮。

5-hmC的富集和检测

工欲善其事，必先利其器。若要了解5-hmC的功能，研究人员首先需要定位并追踪这种修饰，以便了解它如何随着细胞的改变而改变。除了5-hmC的抗体，文献报道了哪些研究方法？而各大公司又推出了哪些产品呢？查文献、翻目录，这太耗时了，让生物通小编来帮你吧。

不得不说，5-hmC的检测颇具挑战性。一方面，它在基因组中以低频率存在，这就需要高度灵敏的检测技术。另一方面，与5-mC相似，5-hmC在亚硫酸氢盐处理后也不转化成尿嘧啶，而是转化成5-亚甲基磺酸胞嘧啶（CMS），故我们常用的甲基化检测方法无法区分5-mC和5-hmC。尽管上文提到的研究使用薄层层析和质谱来检测5-hmC，但这毕竟太复杂，也不可能实现大规模检测。如此看来，5-hmC的研究要另辟蹊径啦。

抗体法

之后的研究发现，基于抗体的富集方法可能有用，因为5-mC的抗体不能识别5-hmC。随后，美国Active Motif公司就开发出了5-hmC的抗体及相关产品。

羟甲基化DNA免疫沉淀（hMeDIP）就是一种基于抗体的富集技术，它利用抗体来选择性富集包含5-hmC的单链和双链DNA片段。随后此抗体/DNA复合物被pull down，从而实现了5-hmC的富集。Active Motif的hMeDIP试剂盒使用了高度特异的5-hmC抗体，能区分5-mC和5-hmC，并检测CpG和非CpG位置的甲基化DNA。磁珠的使用使得捕获相当快速。此外，hMeDIP试剂盒还能与MeDIP试剂盒平行使用，以比较DNA甲基化模式。

去年，美国加利福尼亚大学的研究人员就曾利用这种方法，绘制出第一张人胚胎干细胞中5-hmC的基因组分布图3。他们使用了hmeDIP-seq技术，即先开展羟甲基DNA免疫沉淀，之后在Illumina的Genome Analyzer平台上进行大规模并行测序。他们使用的是Active Motif和Diagenode这两家公司的抗体。在羟甲基化位点的验证过程中，研究人员则使用了NEB公司的EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit。

不过，也有研究人员认为，抗体能特异检测5-hmC，但若是多个修饰集中在一起，则效果更佳，因为抗体与5-hmC的亲和力相对较弱。

β-葡萄糖基转移酶修饰

区分5-mC和5-hmC的另一种方法是对5-hmC残基的定向修饰。几家公司都使用了β-葡萄糖基转移酶（BGT）。这种酶将所有5-hmC糖基化，产生5-ghmC。这个反应是序列无关的，因此所有5-hmC都将糖基化，而C或5-mC则不受影响。

Active Motif的Hydroxymethyl Collector™试剂盒就是利用这种方法，在双链DNA的5-hmC羟基上添加经过修饰的葡萄糖。利用葡萄糖的化学性质，再将生物素结合上去，即可通过链霉亲和素磁珠来实现羟甲基化DNA的富集。这种共价标记确保了5-hmC的准确捕获，是一种将羟甲基化与其他胞嘧啶修饰特异分开的高效方法。只要DNA片段中包含两个5-hmC残基，这种方法就能高效富集。

此外，样品是以双链DNA的形式收集的，便于各种下游应用的文库制备，包括新一代测序。据Pacific Biosciences公司介绍，他们在测序之前，正是通过这种方法处理，一方面富集了5-hmC，减少了测序量，另一方面产生了更大的动力学信号，从而能与5-mC更明显地区分。

NEB公司也很早推出了5-hmC的检测试剂盒，当时还被评为“2010生命科学十大创新产品”。 EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit也是利用β-葡萄糖基转移酶和甲基化敏感的限制性内切酶，实现5-hmC的特异检测。索取资料

具体分析过程如下：

第1步：糖基化
基因组DNA用T4-BGT处理，让所有5-hmC糖基化，产生5-ghmC。这个反应是序列无关的，因此所有5-hmC都将糖基化，未修饰或5-mC DNA则不受影响。

第2步：限制性内切酶消化
MspI和HpaII识别相同的序列（CCGG），但是对不同的甲基化状态敏感。HpaII只切割完全未修饰的位点，胞嘧啶上的任何修饰（5-mC、5-hmC或5-ghmC）都阻碍切割。MspI则识别并切割5-mC和5-hmC，5-ghmC除外。

第3步：PCR分析
用引物扩增实验的靶DNA和对照的靶DNA。如果CpG位点含有5-羟甲基胞嘧啶，那么糖基化和消化之后检测到条带，但是未糖基化的对照反应中没有。如果使用实时定量PCR，那么就可以估计这个位点大概有多少羟甲基胞嘧啶。

NEB网站上有个动画，形象地介绍了这一过程，地址如下：http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/Epigenetics/5hydroxy_both_04.asp。

Zymo Research公司也推出了两个试剂盒：Quest 5-hmC Detection Kit和Quest 5-hmC Detection Kit-Lite，原理大致同上。这两款试剂盒的区别在于前一款包含了MspI，而后一款不包含对5-ghmC敏感的限制性内切酶，你可自由选择一个。内切酶处理之后，可开展多种下游分析，如qPCR、新一代测序、Southern杂交、芯片等。

甲基化敏感的限制性内切酶

使用甲基化敏感的限制性内切酶也是一种区分5-hmC和5-mC的方法。到目前为止，只有PvuRts1 I这种酶能够区分这两种形式的DNA甲基化。PvuRts1 I是5-hmC DNA特异的，不消化5-mC残基或未甲基化的DNA。目前Active Motif公司提供这种限制性内切酶。

此外，NEB 公司提供一系列甲基化依赖性以及对甲基化呈现不同敏感性的限制性内切酶，这类内切酶可以将 DNA 切割成适当片段，有利于甲基化的分析与研究。MspJI 系列内切酶是属于依赖甲基化和羟基甲基化而发挥作用的内切酶，可以将 DNA 切割成以 5-hmC (5-羟甲基胞嘧啶) 和 5-mC (5-甲基胞嘧啶) 为中心的 32 个碱基片段，通过对这些片段的分离、测序，就能绘制出表观遗传学特定修饰位点图谱。

第三代测序更给力

Pacific Biosciences公司开发的单分子实时（SMRT）DNA测序技术则更给力，能直接对5-hmC进行单分子测序4。与第二代测序仪不同，PacBio RS系统利用单个DNA聚合酶分子来开展DNA合成，并监控核苷酸的不断掺入，而不需要扩增。这一点对表观遗传学研究很关键，因为扩增会消除修饰。

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核苷酸掺入的实时记录，不仅产生了序列读取，还带来了关于聚合酶动力学的宝贵信息。通过这些信息，研究人员能鉴别DNA碱基的修饰。一般来说，聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰DNA慢。PacBio将其比喻为路上的减速带，通过减速带时，汽车要慢下来，聚合酶也一样。

通过比较每个模板位点的掺入时间、脉冲间持续时间（IPD），可定量比较这一差异。利用这一方法，研究人员可直接检测DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成，不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。

在测序之前，研究人员还采用了定向富集技术，让修饰检测更为可靠。富集原理同Active Motif的Hydroxymethyl Collector™试剂盒。首先利用β-葡萄糖苷转移酶将叠氮-葡萄糖转移到5-hmC上，产生N3-5-gmC。之后通过点击化学（click chemistry）反应安装一个生物素标签，再利用链霉亲和素磁珠选择性捕获包含5-hmC的DNA片段。之后一个简单的DTT处理就能释放结合的DNA片段，这样5-hmC就修饰成为HS-N3-5-gmC。即使只有一个5-hmC，DNA片段的pulldown产量也约为50%。此外，研究人员通过紫外吸收测定，这种方法是5-hmC特异的，包含5-mC的片段未被pulldown。

通过这种方法，研究人员富集了基因组中的5-hmC，减少所需的测序量。此外，5-hmC上的大体积标签在SMRT测序中产生了更大的动力学信号，以便在较低覆盖度时更自信地确定修饰碱基。

新兴技术

表观遗传学的研究人员也正在积极开发各种新兴技术，来实现5-hmC的更准确、更灵敏检测。波士顿儿童医院等机构的研究人员开发出两种方法，来分析小鼠胚胎干细胞中5-hmC的基因组定位5。

第一种方法称为GLIB。GLIB是糖基化、高碘酸氧化和生物素化的缩写。它主要利用一些酶和化学反应的组合来分离出包含单个5-hmC的DNA片段。首先利用T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（BGT）在每个5-hmC上添加一个葡萄糖分子，然后用高碘酸钠氧化葡萄糖，它将邻近的羟基转化成醛基，之后用醛基反应性探针进一步修饰，在每个5-hmC上添加两个生物素分子，并利用链霉亲和素来pull down。

第二种方法是通过亚硫酸氢钠处理基因组DNA，将5-hmC转换成5-亚甲基磺酸胞嘧啶（CMS），然后利用CMS特异的抗血清将包含CMS的DNA免疫沉淀。

之后，研究人员对小鼠胚胎干细胞中包含5-hmC的片段进行高通量测序。对于GLIB处理的DNA，他们使用了Helicos单分子DNA测序，这种方法不需要扩增步骤，从而避免了PCR偏向。对于CMS富集的基因组DNA，他们使用了Illumina测序仪，其较长的读长适合亚硫酸氢盐处理的DNA与基因组的高效比对。

而上个月的《Science》杂志也报道了一种新方法6。亚硫酸氢盐测序是发现基因组中5mC的标准方法，但它无法区分5mC和5hmC。因此，剑桥大学的化学家Shankar Balasubramanian及其同事在寻找一些化学反应，希望能改变其中一个核苷酸，让它们在测序中以不同的形式读取。

他们将双链DNA暴露在高钌酸钾（KRuO4）中，通过氧化反应在5hmC上添加了一个氧原子，这导致其转化成另一个修饰的核苷酸——5-甲氧基胞嘧啶（5fC），接着开展亚硫酸氢盐测序。在亚硫酸氢盐转化时，这种新的核苷酸（5fC）转化成尿嘧啶。而额外的氧化步骤对5mC无影响，这样研究人员就能区分基因组中这两种核苷酸。

之后，研究小组利用氧化过程来靶定小鼠胚胎干细胞的基因组DNA中的5hmC。利用氧化和亚硫酸氢盐测序过程，他们高度精确地定位了5hmC。将此结果与标准亚硫酸氢盐测序的数据进行比较，研究人员确定了5hmC和5mC的精确位置。

未来，也许更多新技术将会出现，让5-hmC的研究更精准、更轻松。（生物通 余亮）

参考文献：
1. Tahiliani, M., K.P. Koh, Y. Shen, W.A. Pastor, H. Bandukwala, Y. Brudno, S. Agarwal, L.M. Iyer. 2009. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324:930-935.
2. Kriaucionis, S., and N. Heintz. 2009. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324:929-930.
3. Stroud H, Feng S, Morey Kinney S, Pradhan S, Jacobsen SE. 2011. 5-Hydroxymethylcytosine is associated with enhancers and gene bodies in human embryonic stem cells. Genome Biol. 12 (6): R54
4. Song CX, Clark TA, Lu XY, Kislyuk A, Dai Q, Turner SW, He C, Korlach J. 2011. Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Methods. 9: 75-77.
5. Pastor, W.A., U.J. Pape, Y. Huang, H.R. Henderson, R. Lister, M. Ko, E.M. McLoughlin, Y. Brudno, et al. 2011. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature 473:394-7.
6. Booth MJ, Branco MR, Ficz G, Oxley D, Krueger F, Reik W, Balasubramanian S. 2012. Quantitative Sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution. Science. 2012 Apr 26. [Epub ahead of print]