PNAS：新型基因打靶方法

　　

一种新型基因打靶方法利用植物天然修复机制，能将基因操控效率提高两个数量级。

生物通报道：来自德国卡尔斯鲁厄理工学院(德语：Karlsruher Institut für Technologie，缩写：KIT) ，SunGene GmbH公司的研究人员发表了题为“In planta gene targeting”的文章，报道了一种新型技术，能更加精确可靠的靶向靶标，或者修改植物基因组中遗传信息。这一成果公布在《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。

文章的通讯作者是KIT植物分子生物学与生物化学系主任Holger Puchta教授，他曾阐明了植物中双链断裂修复的主要机制，主要研究领域集中于植物中的体细胞重组和减数分裂重组以及绿色基因技术。

为了满足人类的需求，科学家们一直在改良农作物，使之能结出更多的果实，或能在旱地中生存，或具有抗虫害作用。目前随着绿色生物技术的发展，出现了更多能更快更有效改良植物性状，不同于经典育种方法的新工具。这篇文章中提及的新型基因打靶技术就是其中之一。

所谓基因打靶技术（Gene Targeting Method）是指含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。这是一种定向改变生物体遗传信息的实验手段，以此技术为基础，可能制备出新型的研究用模式实验动物和生产用生物反应器。

而这项最新成果则是基于植物天然的修复机制：同源重组（homologous recombination）修复，这种修复方法是DNA双链断裂损伤修复的主要方式，对于保持哺乳动物细胞的基因组完整性十分重要。重组即遗传物质的重排，同源重组是指发生在同源DNA序列间的重组，主要是利用DNA序列间的同源性来识别，而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。

文章的第一作者，KIT的Friedrich Fauser说，“利用一种合适的酶，也就是分子剪刀，我们首次在基因组中完成了精确位点切割，然后将需要的片段修复在了这个切割点上”，“这个片段的一部分就是我们想要加入的新基因片段，接下来就由细胞修复系统自动完成。”

考虑到这个方面，研究人员将这种方法命名为“植物基因打靶（In planta gene targeting，IPGT）”，这种方法具有高精确性，新遗传信息能准确的加入到目标位点。从理论上来说，IPGT能用于每种植物。“相比于传统方法——只能用于某些植物，并且会产生大量的抗拒，这一新方法具有极大的优势”，Puchta教授说。

“利用合适的分子剪刀，片段和细胞中的天然修复机制，IPGT能比目前使用的技术效率高100倍。”

（生物通：张迪）

原文摘要：

In planta gene targeting
The development of designed site-specific endonucleases boosted the establishment of gene targeting (GT) techniques in a row of different species. However, the methods described in plants require a highly efficient transformation and regeneration procedure and, therefore, can be applied to very few species. Here, we describe a highly efficient GT system that is suitable for all transformable plants regardless of transformation efficiency. Efficient in planta GT was achieved in Arabidopsis thaliana by expression of a site-specific endonuclease that not only cuts within the target but also the chromosomal transgenic donor, leading to an excised targeting vector. Progeny clonal for the targeted allele could be obtained directly by harvesting seeds. Targeted events could be identified up to approximately once per 100 seeds depending on the target donor combination. Molecular analysis demonstrated that, in almost all events, homologous recombination occurred at both ends of the break. No ectopic integration of the GT vector was found.