Nature Methods：磁测序

与以往将荧光标记核苷酸加入到DNA分子，进行直接检测观察不同，来自巴黎第七大学的丁方圆（Fangyuan Ding，音译）等人研发出了一种能检测DNA发夹分子长度变化的新技术。相关成果公布在Nature Methods杂志上。

　　

单分子DNA测序取得重要新进展——基于磁镊的测序检测技术

生物通报道：与以往将荧光标记核苷酸加入到DNA分子，进行直接检测观察不同，来自巴黎第七大学的丁方圆（Fangyuan Ding，音译）等人研发出了一种能检测DNA发夹分子长度变化的新技术（具体流程见下图）。相关成果公布在Nature Methods杂志上。

（a.在磁场中，发夹结构被拉长，从而能杂交上测序引物，开始于胞嘧啶C的连接片段启动连接；
  b.当磁场磁性消失，发夹结构重新形成；
  c.在首个碱基是A的下一个连接片段出现的时候，才能连接上引物；
  d.当磁场再次失磁，发夹结构又形成，此时磁珠与玻璃表面之间的距离就代表了一次成功的连接）

如果磁珠相对较大，研究人员就能直接通过简单配有摄像系统的显微镜，直接成像。当引入磁场时，发夹结构被拉伸，解构成一条DNA单链。当关闭磁场的时候，发夹结构就能重新折叠形成。随着磁珠在聚焦点之内和之外漂移，研究人员就能观测到衍射环，从而精确测量磁珠与玻璃表面的距离。

这样就将十分困难的光学问题（检测来自单荧光分子的光信号）化难为简，变成了在亮视场照明下检测微米级磁珠，从而大大的简化了光学设备，只需检测几种核苷酸顺序的长度变化，从DNA发夹到一碱基长的距离。

但是从这种发夹长度变化中如何能读出一条DNA链的序列呢？

研究人员探索了几种方法，首先是杂交测序：当研究人员将一个探针与开发发夹结构杂交时，发夹结构就无法完全折叠，这样就能精确测量到杂交探针的位置。因此当用大量探针一个接一个杂交时，序列就能通过探针重叠的区域读出来。同时用一套小一些的探针能指纹化DNA序列，比如用于病原体的检测。

然而也许连接绑定测序更为合适，这个概念目前已经在Life Technology公司的SOLiD测序仪中实现商业化了。而在最新这篇文章中，则是指将引物通过结合一个短简并核苷酸片段进行一步扩增，这种扩增首先是与腺嘌呤为首的片段进行反应，这时只有当对应DNA链上的下一个核苷酸是胸腺嘧啶的时候才能进行连接。之后是胞嘧啶为首的片段，再然后是鸟嘌呤和胸腺嘧啶，重复这一周期。

在每次连接之后，磁场都会被关闭，从而测量扩增引物的长度。连接上的引物扩增七个碱基，这明显拉大了表面和磁珠之间的距离，从而能检测到。接下来连接片段会在位置2上被清楚，这是为了下一轮做准备，以便下一次连接能紧跟在前一轮的前面。

新一代测序技术（即第二代测序技术），包括来自Roche，Life Technologies，以及Illumina等厂家在内的产品，主要是基于检测克隆DNA。但是这些系统的读长受到限制——每一个化学循环过程中，上千个拷贝中总有一些不可避免会无法得到扩增，从而造成失真和错误累积，最长读长目前少于1kb，一般都在100个碱基左右。

相反真正的单分子测序方法则未受到这种影响，新技术能简单排除失误扩增，而错误结果也与读长无关。实际上目前来自Pacific Biosciences的RS 测序仪已经能达到几千bp的长度了，但是也存在缺点：较高的错误率，这部分是由于单分子荧光信号难以捕捉的问题。

因此这篇最新文章的重要性就由此凸显出来，这种分析单分子的方法无需任何实质上的单分子光学检测，因此也无需其它系统配备的昂贵的高灵敏度光学仪器。

下篇： 新技术突破单分子测序限制

（生物通：张迪）

原文摘要：

Magnetic sequencing

Single-molecule DNA sequencing takes an important step in a surprising new direction with a sequence-detection method based on magnetic tweezers.