专家经验谈：如何开展单细胞qPCR分析（三）[心得点评]

如今，单细胞基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究不再是遥不可及。利用新兴的微流体方法和分子生物学技术，研究人员逐渐能从群体噪音中提取单细胞信号。《Genome Technology》杂志请来了一些专家，来分享他们在单细胞qPCR分析上的经验。通过一问一答的形式，希望能为您的研究带来一点启发。

• 专家经验谈：如何开展单细胞qPCR分析（二）

• 专家经验谈：如何开展单细胞qPCR分析（一）

Q5：您如何定量单细胞qPCR结果？

Mikael Kubista（TATAA生物中心）
单细胞表达谱数据的分析包括三个步骤：normalization、scaling和clustering。用参考基因的表达来均一化（normalization）不适用于单细胞，因为基因表达存在大的、不相关的变化。我们在原先的文章中展示了这一点，自那以后，几乎所有的基因和细胞都证明了这一点，除了mRNA代谢不活跃的细胞（如卵母细胞）外。更好的做法是均一化每个细胞的表达，也就是直接比较测得的量。这是最直观的。当然，这种方法不能说明样品处理过程中的损失，但我们发现那通常可忽略不计。如果您担心样品处理，那么上面提到的RNA加标可用于测定产量和重复性。

对于表达谱分析，数据可以多种方法进行分析。数据可能是unscaled、mean-centered或autoscaled。Mean centering（减去平均值）和autoscaling（减去平均值并除以标准偏差）可平衡分析中标志物的权重。对于单细胞，我们有时候也觉得Mean centering和autoscaling很有用。

Anders Ståhlberg（哥德堡大学）
如果避免了预扩增，数据可转换成绝对的cDNA数量，否则数据分析可以Cq值来开展，因为每个细胞的转录本水平呈对数正态分布。一开始，可以各种方法对数据作图，此外，基本的统计分析也应开展（如阳性细胞的数量、平均值和偏差）。细胞数量测定通常是以验证过的参考基因来均一化的。这种策略在单细胞分析中应避免，因为单个细胞中的所有转录本水平随时间变化。我们发现，校正分析和无监督算法（如Kohonen self-organizing maps）对定义亚群和基因网络很有用。

Finn-Arne Weltzien（挪威兽医学院）
我们在利用单细胞qPCR进行定量测定时很小心。我们通常只进行定性分析。如果我们定量，我们会利用目的基因的拷贝数相对参考基因的拷贝数。

Weiwen Zhang（亚利桑那州立大学，现在天津大学）
对于每个单细胞，我们对目的基因和参考基因进行qPCR分析，如原核生物的16s rRNA和真核生物的28s或actin。不过，我们也注意到，这些常用参考基因的表达水平在单细胞中也差别很大，对大量细胞qPCR的标准定量法则也须特别谨慎。在大部分情况下，我们报告原始和均一化的Ct值，并使用它们进行单细胞qPCR结果的定量。

Q6：您分析时使用哪些生物信息学工具？

Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我们采用GenEx进行单细胞分析。事实上，我们在所有qPCR数据分析中使用GenEx。GenEx强大、用户友好，且支持所有领先的qPCR仪器，这让从实验中导入数据和注释很简单。GenEx有着卓越的数据质量评估，对单细胞研究很重要，以及强大的单细胞表达谱工具。它有着用户友好的界面，即使是没有经验的用户也能使用那些强大的工具。

Anders Ståhlberg（哥德堡大学）
我使用GenEx和SPSS开展数据分析。

Weiwen Zhang（亚利桑那州立大学，现在天津大学）
对于几十个基因的分析，我们采用ANOVA student t-test或其他简单的统计学工具。不过，如果以扩增的单细胞cDNA作为模板，分析几千个基因，则可能需要更先进的生物信息学工具。