专家经验谈：如何开展单细胞qPCR分析（一）[心得点评]

随着现代生物学的发展，细胞群体的研究已不再能满足我们的需要。科学家们开始解析单个细胞的行为。而单细胞技术在最近几年也一直被《Nature Methods》杂志列为值得关注的技术。

如今，单细胞基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学研究不再是遥不可及。利用新兴的微流体方法和分子生物学技术，研究人员逐渐能从群体噪音中提取单细胞信号。《Genome Technology》杂志请来了一些专家，来分享他们在单细胞分析上的经验。通过一问一答的形式，希望能为您的研究带来一点启发。

Q1：您首选的细胞捕获和裂解方法是哪种？为什么？
Q2：您如何产生适合qPCR的单细胞cDNA文库？
Q3：在改善单细胞qPCR实验设计上，您有哪些建议？
Q4：您采取哪些步骤来减少实验误差以及噪音？
Q5：您如何定量单细胞qPCR结果？
Q6：您分析时使用哪些生物信息学工具？

Q1：您首选的细胞捕获和裂解方法是哪种？为什么？

Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我们最常用的是荧光活化细胞分选（FACS）。对于可分离的样品，FACS在高通量工作中最方便，并且可轻松整合到我们的流程。我们对特定细胞类型也使用免疫磁性富集，例如，收集循环中的癌细胞。对于裂解，我们使用自己的CelluLyser或罗氏的Real-Time Ready Cell Lysis试剂盒。

Anders Ståhlberg（哥德堡大学）
显微抽取、流式细胞术、激光捕获显微切割（LCM）或自动化的微型设备都可用来收集单个细胞。每种方法都各有利弊。目前我正在使用流式细胞仪来收集各种细胞类型。FACS将细胞分选到PCR板上，与RT-qPCR仪器兼容。此外，FACS可利用特定的细胞标志物实现细胞富集。FACS的通量比LCM要高得多。但FACS的缺点是你无法观察细胞，确定重要参数，如细胞形态。FACS还需要单细胞悬液，因此，细胞的过去无从知道。

为避免RNA损失，我们使用与下游酶学反应兼容的裂解缓冲液，而无需进一步纯化。目前市场上有一些裂解液可供选择：CelluLyser（TATAA生物中心）、Real-Time Ready Cell Lysis（罗氏）、Single Cell-to-CT（Life Technologies）等。我们注意到，不同的细胞类型需要不同的裂解液。我们倾向于使用弱的裂解液—水和非商业化的缓冲液—以避免对下游反应的抑制。如果需要较强的裂解液，我曾用过CelluLyser和Real-Time Ready Cell Lysis缓冲液，还不错。

Finn-Arne Weltzien（挪威兽医学院）
根据我们的经验，假阳性是单细胞qPCR中的一个主要问题，特别是原代解离细胞。因此，对于原代解离细胞，我们倾向于通过玻璃移液管来收集细胞质。在处理细胞系时，收集整个细胞通常效果不错。

Weiwen Zhang（亚利桑那州立大学，现在天津大学）
我们在单细胞分离上曾使用过几种方法，如细胞捕获、细胞显微操作等。理想方法是取决于样品的性质和研究目的。

我们曾成功使用细胞显微操作仪在显微镜下分离单个真核细胞和细菌。单细胞可捕获并加入预装有40μL PBS缓冲液的PCR管（0.2 mL）或微管（1.5 mL）中。随后细胞可利用商业化的试剂盒（如ZR RNA MicroPrep Kit，Zymo Research）裂解以分离RNA，或裂解后直接开展RT-PCR。显微操作的缺点在于其通量的确不高。

Q2：您如何产生适合qPCR的单细胞cDNA文库？

Mikael Kubista（TATAA生物中心）
我们只通过基于PCR的预扩增。在我们看来，TaqMan PreAmp Master Mix（Life Technologies）是最佳的试剂盒。正确处理样品是最重要的。没有经验的话，很容易犯错误。我们在欧洲提供单细胞图谱分析服务，包括与Life Technologies合作，通过数字PCR来准确测定拷贝数。

Finn-Arne Weltzien（挪威兽医学院）
我们对细胞质/细胞裂解液直接开展逆转录。

Weiwen Zhang（亚利桑那州立大学，现在天津大学）
从单细胞中分离RNA之后，使用适当的逆转录步骤。产生的cDNA通常足以测定单细胞中十几个高表达的基因。不过，如果要测定更多的基因，需要扩增cDNA。目前文献中有几种方法来扩增cDNA，不过它们可能的偏向仍有待进一步评估。

（未完，待续）

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