专访首个找到哺乳动物雌性生殖干细胞的科学家吴际教授

近期《Nature Medicine》的一项有关生殖干细胞的成果受到了大家的关注，一些外媒报道中也提及了我国上海交通大学吴际教授2009年的一项领先成果，但是新闻报道言辞却未能准确的描绘出相关技术的关联性，生物通特联系了吴际教授，她就一些关键问题进行了解释和澄清，从另外一个角度解析了这些成果……

　　

生物通报道：2月26日《Nature Medicine》报道了美国麻省总医院（MGH）Jonathan Tilly研究组的一项最新成果——从育龄期妇女的卵巢中首次成功分离出可生成卵细胞的干细胞，这项重要的成果吸引不少眼球，各大媒体纷纷进行了报道。

在一些外媒报道中也提及了我国上海交通大学吴际教授2009年的一项领先成果：首次在出生后的小鼠(包括成年和出生五天的小鼠)卵巢中发现了生殖干细胞，但是新闻报道言辞却未能准确的描绘出相关技术的关联性，就此生物通特联系了吴际教授，她就一些关键问题进行了解释和澄清，从另外一个角度解析了这些成果。

新研究采用的是吴际教授开创的分离方法和思路

在某些报道中称在新研究中，Tilly研究组采用了“一种更精细的细胞分选技术”，但实际上，这篇最新Nature Medicine发表的文章中其实就是按照吴际教授开创的分离方法和思路，只是略加修饰。

生物通：在新闻（http://www.eurekalert.org/pub_releases/2012-02/mgh-mgr022112.php）原文提及“the protocol used to isolate OSCs in the 2009 Nature Cell Biology study is a relatively crude approach that often results in the contamination of desired cells by other cell types（研究人员采用了相对简略的方法来分离OSCs，这有可能会导致其他类型细胞的污染）”。Tilly认为“The 2009 study from China also had isolated OSCs based on cell-surface expression of a marker protein called Ddx4 or Mvh, which previously had been found only in the cytoplasm of oocytes……it was expressed on the surface of a rare and distinct population of ovarian cells identified by numerous genetic markers and functional tests as OSCs”，提出这一标记蛋白：Ddx4/Mvh也出现在某种罕见的卵巢细胞的细胞表面，这造成了细胞污染。

吴教授：以免疫亲和技术为基础的分选细胞方法通常能获得高纯度的细胞, 它包括免疫磁珠分选法(MACS)和荧光激活细胞筛选法（FACS）。这两种方法只是操作的步骤不同，但原理都是细胞和某种特异性蛋白结合，在磁场或者流式细胞仪的分选作用下将该种细胞分离，所以只要使用同一种特异性蛋白分选，无论是使用MACS还是FACS法，得到的细胞都是同一种类型的细胞。MVH是生殖细胞特异性表达蛋白，且主要在细胞胞质中表达。

我们课题组(2009年发表的成果)首先通过生物信息学的方法预测出MVH蛋白含有跨膜结构域，并将其用于小鼠雌性生殖干细胞的分离，实验结果证实了我们的预测，首次获得了雌性生殖干细胞。这一结果于2009年发表在Nature Cell Biology (2009; 11: 631-636)上。从而首次阐明具有跨膜结构的胞质蛋白，只要能获得含有跨膜结构域的特异性抗体均能用作细胞分选的特异性蛋白。因此，大大扩大了上述两种方法的使用范围。因传统用于上述两种方法中的特异性蛋白通常为膜蛋白，但该类蛋白数量有限，故使上述两种方法使用受到限制。

Tilly课题组于2012年发表在Nature Medicine的文章，也是用MVH作为特异性蛋白进行分选，只是用了FACS而已，并成功的分离到了雌性生殖干细胞，这一结果与我们的研究结果一致，并验证了我们研究结果的正确性。因为我们和Tilly课题组都是用MVH作为分选标志物，所以不论是用磁珠还是流式，分离到的细胞都是一样的，无细胞污染之别。

生物通：据生物通了解，您的研究组是第一个提出并用Ddx4因子筛选并分离出OSC的，Tilly在发表的文章中其实同样沿用的您开创的分离方法和思路，只是略加修饰。Ddx4/Mvh也出现在另一种罕见的细胞表面是什么时候发现的？会对您创立的方法有哪些影响？是否会影响文章的结论？具体情况可否给我们读者介绍一下？有什么方法能确保获得纯的OSC？

吴教授：是的，我们是第一个提出并用Ddx4/MVH因子筛选并分离出雌性生殖干细胞的。Tilly课题组在2012年Nature Medicine发表的文章中其实是按我们开创的分离方法和思路，只是略加修饰。
MVH/Ddx4是生殖细胞特异性标志物，因此使用MVH分离到的来自出生后小鼠卵巢细胞是由雌性生殖干细胞(FGCS, OSC)和少量卵母细胞组成的生殖细胞。由于卵母细胞在体外并不能长期存活，在我们的培养条件下，两周内所有的卵母细胞都会死亡，因此得到的都是能够自我更新的雌性生殖干细胞。由于Tilly课题组所用的方法和我们的方法基本是一致的，因此Tilly课题组的这篇论文的发表是对我们工作的进一步验证，而并不会影响我们原有的结论。

生物通：可否这么说：其实这篇文章应该说在您研究组创立的方法的基础上进行完善，也就是说再次证实了您创立的分离OSC的方法可行，且可以用于人类OSC的分离，只是还需要完善？

吴教授: 是的。

磁珠分选法不存在这类污染的问题

新研究认为磁珠分选法存在磁珠洗不干净的问题，吴际教授指出通过磁珠分选法不存在这类污染的问题。

生物通：这些研究都采用的了流式细胞分选技术，流式细胞技术主要是分选细胞表面的蛋白标记，但文章指出Ddx4这一因子存在于卵母细胞胞质中，那这是如何分选出来的呢？目前还有哪些方法能分离OSC？

吴教授：本问题的第1问，在问题1时已回答。但详细了解小鼠雌性生殖干细胞分选方法，可以参考我们所发表的论文（Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries. Nature Cell Biology，2009和Improved efficiency of female germline stem cell purification using fragilis-based magnetic bead sorting. Stem Cell and Development，2011）
我们除了使用MVH外，还辨认了另外一种用于雌性生殖干细胞分选的特异性蛋白Fragilis。

流式细胞仪分选方法适合细胞较多的情况下分选, 而磁珠分选方法适合细胞数目较少的样本分选。Tilly课题组是收集了六个做变性手术人的全部卵巢, 有大量的细胞样本，所以采用流式细胞仪分选法。文章中说用磁珠洗不干净的问题，我们在Improved efficiency of female germline stem cell purification using fragilis-based magnetic bead sorting. Stem Cell and Development 2011这篇文章中已经讨论得很清楚了, 通过磁珠分选法不存在这类污染的问题。

生物通：原作者还提及，“Additionally, although the Chinese team had transplanted OSCs into ovaries of mice previously treated with chemotherapy, the MGH-Vincent team showed that it was not necessary to damage the recipient mouse ovaries with toxic drugs before introducing OSCs”，请问您认为Tilly文章中以GFP标记有什么特别之处吗？和您2009年的文章中的方法相比，结论是一样的。

吴教授：Tilly课题组做的研究，之所以没有进行药物处理，是因为他们的实验涉及到了人并且不能因实验而在人的身上进行化学药物处理。他们和我们都是通过用反转录病毒将GFP标记到生殖干细胞上，然后将干细胞移植到受体卵巢中，我们的实验通过药物杀死生殖细胞后，植入的生殖干细胞能够在受体小鼠卵巢内定植并分化成GFP阳性的卵母细胞，这样就更加能证明这些GFP阳性的卵母细胞是来源于我们移植的细胞。总之，我们和Tilly课题组得到的结论是一致的，只是因为我们是首次移植，所以为了更加确认实验结果才采取了药物注射来清除受体原有的生殖细胞，而Tilly课题组不注射药物是因为涉及到人类实验所以才没有注射药物，两者之间并没有矛盾, 结论是一样的。

 

生物通：最新这篇Nature Medicine论文在小鼠和人类细胞中都进行了实验，您认为造成这两项成果差异的原因是否是由于人类细胞与小鼠细胞的差别？原文作者提及其文章第3个重要意义在于首次从人分离出OSC细胞。您的小组在2009年之后有没有做过人细胞的实验？为什么？一般人都认为在中国大陆地区的伦理管制相对较为宽松，您认为在研究中有哪些困难？

吴教授：我们课题组经过多年漫长的探索，创建了小鼠雌性生殖干细胞的分离，纯化, 鉴定和体外建系方法，从而首次阐明从成年哺乳动物卵巢内能够分离出具有自我更新和分化潜能的雌性生殖干细胞并定位该细胞为卵巢皮质表面而不是卵巢柱状上皮表面（Nature Cell Biology，2009; 11: 631-636 ）。

我们随后的工作包括利用雌性生殖干细胞创建了高效、快速、经济、简便的转基因和基因沉默动物模型方法（Journal of Molecular Cell Biology，2011; 3: 132-141），以及辨认了另外一种用于雌性生殖干细胞分选的特异性蛋白Fragilis，大大提高了分选效率（Stem Cell and Development, 2011; 20: 2197-2204）。 Tilly课题组的工作在很大程度上是基于我们2009年发表在Nature Cell Biology的工作，扩大到用于人类的研究，人和小鼠有很高程度的相似，但也存在着一些细节上的区别。我们课题组其实早就开展了人类雌性生殖干细胞的研究，并取得了一定的进展，但由于未获得较大的支持和重视等，使该研究落后于Tilly课题组。一方面我们对Tilly课题组所取得的成果表示祝贺，另一方面也为我们的工作进展比他们慢一步表示非常的遗憾。

更多有待进一步探讨的问题

无论如何，这些成果无论对于基础研究还是临床来说都具有重要的意义，当然也还存在一些有待更深入探讨的问题。

生物通：联系到生物通早期报道过，2005年研究人员发现骨髓或血细胞移植可以重新恢复化疗导致生育力丧失的成年雌性小鼠的卵母细胞生成能力，您认为这种作用是通过骨髓干细胞直接分化的，还是骨髓移植某种因子刺激卵巢中的OSC，生成卵母细胞的呢？Tilly等人表示希望不引入遗传物质的情况下能“激活”老年妇女的“失去功能的”卵子，最终能实现恢复生育能力，您认为前景如何？

吴教授：“发现骨髓或血细胞移植可以重新恢复化疗导致生育力丧失的成年雌性小鼠的卵母细胞生成能力”的工作是Tilly课题组在2005年发表在Cell的工作。他们的工作证明成年小鼠卵巢中具有增殖活性的生殖细胞来源于骨髓或血细胞 （Cell 2005，122: 303-315 “These results identify BM (bone marrow) as a potential source of germ cells that could sustain oocyte production in adulthood”）。从我们的实验结果 (Nature Cell Biology, 2009; Journal of Molecular Cell Biology，2011; Stem Cell and Development, 2011) 和Tilly课题组最新发表的这篇Nature Medicine (2012) 论文结果显示成年小鼠卵巢中具有增殖活性的生殖细胞不是源于骨髓或血细胞, 而是成年小鼠卵巢本身存在雌性生殖干细胞。

生物通：在这些研究中获得的这种生殖干细胞是从卵巢中的具体哪一部位提取出来的？是否采用了诸如免疫组化等方法确定了这些细胞在卵巢中的定位？OSC的定位将有助于揭示其生理功能。您认为OSC的潜在生理功能是什么？在那些情况下能让“她们”恢复生产生殖细胞的能力？

吴教授：小鼠雌性生殖干细胞是从卵巢皮质的表面分离到的，是先通过体内的BrdU/MVH免疫荧光双标记实验进行定位，然后再通过MVH或者Fragilis进行分选。雌性生殖干细胞的生理意义就是对卵巢内的生殖细胞进行补充，具体调控机制需进一步实验证明。

生物通：在另外一篇来自新闻（http://the-scientist.com/2012/02/27/ovarian-stem-cells-in-humans/）中，也有研究人员对最新这项成果提出了质疑，认为“While the results provide the first good evidence that women may produce eggs into adulthood, not everyone is ready to begin modeling the ovary after the testes……uibbles with Tilly’s assertion that the OSCs he’s isolated are ‘mitotically active’”，怀疑其成果中的分离细胞是有丝分裂活性期的细胞，那么这对于这项成果的可信度有何影响呢？

吴教授：关于其他科学家对于雌性生殖干细胞的有丝分裂能力的质疑，我们觉得最好的回答就是充分的实验证据。我们课题组早已在2009年发表在Nature Cell Biology的工作中从mRNA水平，蛋白水平和细胞水平都已证实，我们所建立的雌性生殖干细胞系确实具有有丝分裂活性。关于雌性生殖干细胞存在于出生后哺乳动物和人类卵巢是不容置疑的事实。

生物通：您的研究组的工作具有重要意义，将能改写教科书内容，假如能找到一种方法激活OSC，妇女能持续排卵，那是不是说，就不会有更年期的问题？女性将可以再获得更多青春？

吴教授：每种干细胞在体内都受到微环境的调控，在没有完全弄清楚调控机制之前应该尊重正常的生理规律，不应该人为的干扰干细胞的生理特征，否则不仅可能不利于健康，而且有可能发生其它疾病的风险。因此，如果用于抗衰老必须在弄清楚调控机制之后才能进行。

编后语：
罗马不是一日建成的，技术也不是在一天之内就能获得突破的，中国科学家在创新能力方面不逊于其它任何国家的科学家，比如吴际教授研究组开创的这一新技术就是个范例。而对于之后未能及时获得这一新进展，我们除了一声叹息之外，更多的是希望针对这一课题，能有更多的支持和重视。

（生物通编辑部）

原文检索：
Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women，Nature Medicine  2012；DOI: doi:10.1038/nm.2669
Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries，Nature Cell Biology  2009; 11: 631-636
Production of transgenic mice by random recombination of targeted genes in female germline stem cells，Journal of Molecular Cell Biology，2011; 3: 132-141
Improved efficiency of female germline stem cell purification using fragilis-based magnetic bead sorting，Stem Cell and Development, 2011; 20: 2197-2204

吴际博士：
上海交通大学Bio-X研究院特聘教授, 博士生导师
所属学科 生物化学与分子生物学
研究方向 1. 生殖干细胞生物学; 2. 生殖医学与再生医学