聚焦三大数字PCR平台（一）[新品推荐]

在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是绝对定量呢？如今，你无需纠结了，因为数字PCR（digital PCR或dPCR）来了。尽管这两种技术有些类似，都是估计起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而dPCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

数字PCR技术，是通过将微量样品作大倍数稀释和分液（partitioning），直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。

图片来自Life Technologies

它是一种绝对测量方法，因为在这种条件下，只有含有1个目标分子的样品才能被不断放大至几百万倍的程度，其所产生的信号（例如荧光）将会非常强，以致可通过数个数的办法进行绝对测量，其他样品即使含有会产生干扰信号的杂质分子，但是由于杂质分子不可能发生PCR扩增，因此其信号将不可能达到能影响最终检测结果的程度。

数字PCR的概念其实早在1999年就由Vogelstein和Kinzler提出，其初衷是为了能够从大量的正常细胞中检测出突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的优势。

2006年，美国Fluidigm公司开发出第一台商业化的数字PCR系统，它是基于集成流体通路（IFC）芯片。2010年，Life Technologies也推出了数字PCR产品线 – OpenArray系统。之后，QuantaLife公司开发出微滴数字PCR（ddPCR）技术，并因此获得2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，推出了QX100微滴式数字PCR系统。

Fluidigm与IFC芯片

Fluidigm公司结合微流体技术，生物技术和微电子等技术，于2006年底推出了Bio-Mark™ 高通量基因分析系统。其创新就在于集成液体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增。集成流体通路技术极大地简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，其纳升级的反应体系为高通量的基因分析应用节省大量成本（试剂用量更少，样品量更少）。

Bio-Mark™基因分析系统由Bio-Mark™实时PCR系统（整合了高性能计算机）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（将生物样品、反应试剂导入到IFC微液流芯片中）和数据分析软件四部分构成。IFC微液流芯片有2种：Dynamic Array（48.48动态芯片和96.96动态芯片）和Digital Array（12.765数字芯片和48.770数字芯片），应用于不同的基因分析中：拷贝数变化分析、遗传突变检测、基因分型、基因定量、单细胞基因表达等。

数字芯片将预混液（样品与PCR试剂）分成数百个单独的PCR反应，开展数字PCR分析。整个过程分为五步：准备芯片；将每个样品预混液移液至芯片的独立入口；将芯片放入IFC Controller，利用软件界面迫使分析组分进入单独的反应板；将芯片放入BioMark系统，开展热循环和荧光检测；利用分析软件来查看和分析扩增曲线。

Fluidigm公司分子生物学主管Ramesh Ramakrishnan认为，数字PCR的流程显然比传统的qPCR更简单，但通量较低。然而，数字PCR更特异，特别是在搜索稀有突变时。拷贝数变异分析就是一个很好的例子。采用12.765数字芯片，通过数字PCR，每个反应体系用量仅6 nL，可有效分辨12 与13 倍（或更高）的差异。

Fluidigm如今正努力让微流体芯片变得更灵活，包括每个芯片的样品量和每个样品的分液数量。Ramakrishnan表示：“目前我们每块芯片上能够开展最多48个不同样品的数字PCR，且每个样品能够分成770个单独的反应仓。我们正在探索新的芯片形式，以便更改每块芯片的样品数量以及每个样品的反应仓数量。”（未完，待续）

• 聚焦三大数字PCR平台（三）

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（生物通 余亮）