利用IN Cell Analyzer 2000系统分析干细胞克隆[创新技巧]

利用自动化荧光显微镜进行的高内涵分析能够在单细胞水平产生信息量丰富的数据，非常适合干细胞培养和分化研究。对于这些分析的自动化成像，挑战在于在常规的96孔板形式中，干细胞克隆的位置并没有预先确定。这就需要获取每个孔的多个视场，来确保全部区域都被覆盖。本文将显示全新的IN Cell Analyzer 2000系统的特征如何克服这些困难。

¹ Robert Graves*, ¹ Zahra Masoumi & ² Alla Zaltsman
¹美国新泽西州通用电气医疗集团；²英国英格兰白金汉郡安玛西亚镇通用电气医疗集团
e-mail: [e-mail]

简介

人们普遍预测干细胞研究将会对多种人类疾病的了解及最终治疗产生重大影响。1 干细胞的特征是具有分化成多种细胞表型的能力（多能性），但培养时分化的程度完全取决于细胞生长条件，而培养物多能性的维持常常离不开滋养层细胞。这些细胞的特征之一是当它们处于未分化状态时，一般以紧密挤压的细胞克隆生长。

利用自动化荧光显微镜进行的高内涵分析能够在单细胞水平产生信息量丰富的数据，非常适合干细胞培养和分化研究。2 多能性通常是通过特定标志物如Oct-4的抗体检测来监控的，而分化的程度则通过不同细胞谱系的特定标志物的外观来测量。对于这些分析的自动化成像，挑战在于在常规的96孔板形式中，干细胞克隆的位置并没有预先确定。这就需要获取每个孔的多个视场，来确保全部区域都被覆盖。这一点很实际，特别是当相对稀有的事件被检测到，如干细胞克隆中的部分细胞在特定的时间点活跃地发生着有丝分裂。当需要多张图像来捕获全孔时，克隆有时候很大，重叠了图像边界，这样就很难准确判断克隆数量和形态。

下文的数据将显示全新的IN Cell Analyzer 2000系统的特征如何克服这些困难：(1) 大芯片照相机能在2倍物镜下实现高通量单图像全孔捕获，而图像阴影最小，同时又有足够的图像分辨率来区分单个细胞；(2) 对于高放大率成像，用户控制的命令能移动/改变目的克隆的物镜，而无缝图像拼接实现了高分辨率的全孔成像。

IN Cell Investigator软件能实现克隆与滋养层细胞的同时分析。此软件还能自动拼接图像，测量克隆数目、大小、形状，确定细胞数量，并定量克隆的表型标志物。

方法

包含未分化干细胞克隆和滋养层细胞的预染色固定样品的96孔板是由加利福尼亚大学干细胞研究中心的Peter Donovan教授馈赠的。所有的细胞核用Hoechst染色，多能细胞通过Oct4的荧光抗体检测来分析，有丝分裂细胞则利用磷酸组蛋白H3的Texas Red结合抗体来检测。培养条件及处理的详细方法可参照加利福尼亚大学实验室的近期论文。4,5

图像获取
图像是利用2倍物镜（0.1NA）、透射光和荧光模式及适当的滤光片和曝光时间在IN Cell Analyzer 2000系统上获得的。大的照相机尺寸再加上2倍物镜，能获得每边7.6 mm的视场，在单次图像捕获时覆盖96孔板的全孔区域（直径6.5 mm）。图像还利用4倍物镜（0.1 数值孔径）获得，此时全孔捕获就需要4个像场。4倍物镜图像有5%的重叠，以便能利用IN Cell Investigator（Developer工具箱）软件进行图像拼接。

 

图1. 96孔板单孔中的干细胞克隆和滋养层细胞在2倍物镜下的荧光全孔图像。细胞核经Hoechst染色后所获得的图像，它标出了干细胞克隆和滋养层细胞中的所有细胞核(A)。多能干细胞则利用荧光标记抗体检测Oct4表达来鉴定(B)。

图1显示了干细胞克隆和滋养层细胞所获得的典型图像。此类图像的定量分析策略概括在图2中。

图2. 干细胞克隆和滋养层细胞的图像分析。所有的细胞核经Hoechst染色(A)，并利用IN Cell Investigator（Developer工具箱）的自动化图像分析来检测(B)。借助用户定义的对象扩大、孔填充和大小过滤等后处理工具，这些克隆作为单独的目标组从所有细胞核中区分开来(C)。随后使用目标连接（target-linking）来确定与克隆有重叠的细胞核(D)。一旦所有的目标都被指定，软件会自动计算这些对象的数目、形态描述符以及荧光密度相关的测定。

图3显示了克隆中稀有事件的分析，如有丝分裂细胞的数量。

图3. 干细胞克隆中稀有事件的逐个细胞分析。一旦利用IN Cell Investigator鉴定出干细胞克隆(A, B)，就能确定Oct4表达(C)和磷酸组蛋白H3(D)阳性的克隆特异细胞核的数量。软件自动计算出表达这些标志物的克隆特异细胞核的比例(E)。

表1. 图3E中3个高亮克隆的干细胞克隆分析的典型数据。

2倍物镜所提供的分辨率已足以进行全孔图像的逐个细胞分析，单个克隆的汇总数据如表1所示。我们已经将全孔2倍图像的分析数据与4倍物镜下图像的对应结果进行了比较，在4倍物镜下每孔需要4个视场来完整覆盖。

图4. 2倍与4倍图像的分析数据比较。利用4个像场对4倍物镜下所获得的全孔图像进行了图像拼接(A)。对2倍图像(B)及对应4倍拼接图像中的10个随机选择克隆进行了分析。柱形图显示了2倍或4倍分析中克隆面积和每个克隆的总细胞核计数的比较数据。

图4的结果显示2倍物镜下所获得的全孔图像分析数据不亚于4倍物镜下相同孔所获得的相似分析数据。我们还研究了干细胞样品板的明场成像及分析。初步结果显示，利用Developer的高级图像预处理功能，克隆计数及形态学分析都是可行的。

图5. 4倍物镜下所获得的明场拼接图像与荧光下所获得的全孔2倍图像的比较。利用Developer软件的图像拼接，显示了利用4个像场在明场的4倍物镜下所获得的全孔图像(A)。对2倍全孔荧光图像(B)及相同孔的4倍物镜明场拼接图像(C)中的10个随机选择克隆进行了分析。柱形图显示了2倍荧光或4倍明场分析中克隆面积的比较数据。

小结

 IN Cell Analyzer 2000能利用荧光和透射光模式，进行干细胞的自动成像。
 系统的大照相机在2倍物镜下能捕获7.6×7.6 mm2的视场，实现快速的96孔板单图像全孔捕获。

结论

 2倍物镜的分辨率对于干细胞克隆的单细胞分析已经足够，其数据与利用4倍物镜所获得的数据相当。
 更高分辨率的全孔成像可以通过系统的视场重叠功能及IN Cell Investigator的自动图像拼接来实现。

欢迎索取IN Cell高内涵分析平台的更多资料