利用IN Cell Analyzer 2000对模式生物进行自动化全孔成像[创新技巧]

斑马鱼和线虫作为药物开发和毒性研究的模式生物，在成像和分析上的兴趣日益增长。而大部分显微镜和高内涵成像系统即使在2倍放大率下，还是需要对多个视场进行成像，以确保全孔都被覆盖。在此我们展示了IN Cell Analyzer 2000在斑马鱼分析应用中的全孔成像能力。

作者：¹ Ahmad Yekta*, ¹ Zahra Masoumi, ² Albie Santos & ¹ Daniel Manning
¹美国新泽西州通用电气医疗集团；²英国英格兰白金汉郡安玛西亚镇通用电气医疗集团
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简介

斑马鱼和线虫作为药物开发和毒性研究的模式生物，在成像和分析上的兴趣日益增长。成体斑马鱼在长度上会生长至约4 cm，然而许多有用的研究都是针对其受精后5天（5-dpf）的近乎透明的幼虫而开发，而幼虫的大小约为< 4 mm。为此，96孔形式的微滴定板是最适合的试验板，因其孔有着足够的碳酸水容量，能维持斑马鱼的生存。此外，每孔中只放入1条鱼是比较理想的，这样它的健康状况就不会影响到邻居的生存。

这些需求减慢了大部分显微镜和高内涵成像系统的通量，因为即使在2倍放大率下，还是需要对多个视场进行成像，以确保全孔都被覆盖。在此我们展示了全新的IN Cell Analyzer 2000系统的特征如何克服这些困难：(1) 大芯片照相机能够在2倍物镜下进行快速的单图像全孔成像，而图像阴影最小；(2) 对于更高放大率的成像，用户控制的命令能移动/改变目的区域的物镜，而无缝的图像拼接能得到高分辨率的全孔图像；(3) 两种独立的自动对焦模式能实现精确的z-叠加，因此任意两个器官的垂直距离都能够确定。

方法

样品制备：
斑马鱼幼虫样品是由Phylonix Inc.馈赠的。受精后5天的野生型斑马鱼先在三卡因中麻痹，再用4%多聚甲醛固定。幼虫放置在#3599 Corning Costar 96孔板的150 μl固定培养基中。

图像获取：
图像是用IN Cell Analyzer 2000获取的。物镜为：2×/0.1 NA、4×/0.1 NA、10×/0.45 NA，利用透射光和荧光模式及适当的滤光片和曝光时间。大CCD照相机（(Photometrics CoolSnap K4)，加上2倍物镜，能获得7.6×7.6 mm2 的视场，在单次图像捕获中覆盖96孔板的全孔（直径6.4 mm）。

为了捕获z维的整个斑马鱼，我们获得了Z-叠加物（图4），每次叠加100张图片，间隔10 μm（表2），总距离为1000 μm。

图像拼接与分析：
对于更高分辨率的全孔成像，在5%重叠时使用了仪器的自动图像重叠特征。这样就能对全孔或目的区域进行成像。之后，图像文件转移到IN Cell Investigator 1.5，在那里进行自动的图像拼接，产生1幅每个孔的图像。

幼虫在孔底部的放置、排列及姿势

在研究的样品中，麻痹或固定的受精后5天斑马鱼幼虫沉在孔底部。体轴相对于板侧面的排列是随机的，但有一个附着倾向，就是斑马鱼头部对着孔壁。姿势多半是侧面的，这样只能对1个眼睛进行成像（图2）。约有10%的幼虫呈现头部部分偏向腹部的姿势，在图像中就能看见1½到2个眼睛（图4）。

IN Cell Analyzer 2000的视场（FOV）大小

系统的大CCD芯片照相机有着正方形的视场，每一侧为2048像素。视场的尺寸取决于物镜的选择，如表1所示。

斑马鱼的单拍全孔成像的需要

在自动成像中，通量的需求要求目的样品放置在单个视场内并成像。根据我们的经验，斑马鱼幼虫的最佳放置形式是96孔板，因为它含有足够量的碳酸水（~ 150 μl）以维持鱼的生存。每条鱼应放置在单个孔中，以避免交叉污染的作用。

既然幼虫在孔中的位置是相当随机的，那么就需要对全孔成像，以免错过样本。图1显示了在2倍物镜和7.6×7.6 mm2 的视场下，IN Cell Analyzer 2000的大CCD照相机很容易在单次拍摄中覆盖每个孔的全部区域（孔直径为6.4 mm）。这样，每天就能对几千条斑马鱼进行自动成像。

图1. IN Cell Analyzer 2000自动获取的受精后5天斑马鱼图像的缩略图。2倍物镜、Corning Costar #3599 96孔板、每孔150 μl水。上面3行，透射光；下面3行，FITC荧光通道。

图2显示了斑马鱼透射光图像的放大浏览。2倍放大率的单图像捕获满足了许多需要在器官水平测量的分析应用的需求。这是因为2倍放大率下系统的分辨率（图像像素大小）约为3.7 μm/像素，而即使小的器官如心脏约为100倍大，为准确的形态测定和密度测量提供了足够的分辨率。

图2. 受精后5天未染色的斑马鱼在IN Cell Analyzer 2000上的全孔透射光图像。2倍物镜、自动对焦、96孔板（Corning Costar #3599）、150 μl水。正方形的图像视场，7.6 mm；圆孔直径，6.4 mm。尽管在大视场下孔中心到边缘的密度不均匀性很小，但如果需要，也可通过平场校正来轻松调整。在图像获取过程中，大小参照条也包含在内。

图3. IN Cell Analyzer 2000在透射光模式下对受精后5天未染色的斑马鱼的尾部区域进行成像。10倍物镜、自动对焦、96孔板的说明见图1。尽管幼虫是近乎透明的，但鳍、脊索、泌尿生殖器开口和色素细胞清晰可见。大小参照条是自动捕获的。

IN Cell Analyzer 2000系统采用两种方法来获取更高分辨率的图像，以观察斑马鱼细胞水平的体内细节。举个例子，你可能想通过荧光染色细胞的测量来检测神经毒性作用[2]。第一种方法，你可以在2倍物镜下对每个孔的幼虫进行快速全孔成像，然后通过电脑控制将物镜转变成10倍（或20倍），再将XY镜台移动并定位到感兴趣的器官区域（如图3所示）。

第二种方法在需要高分辨率的全孔覆盖时特别有用（如每孔多个生物体），你可以选择系统的场重叠特征（如5%重叠），并获取适当数量的图像。例如，在10倍物镜下，你需要获取25个视场来覆盖全孔（表1）。接下来，这组图像传输到IN Cell Investigator 1.5 应用中，来进行无缝的图像拼接和分析。

斑马鱼的自动Z叠加成像

样本的轴向厚度取决于成像时的躯体面积，可在0.2至1 mm之间变动。IN Cell Analyzer 2000的Z叠加成像特征可用于从幼虫中提取三维的信息。

对于常规的成像（无需Z切片），你需要考虑厚样本所发生的图像模糊的影响。尾部区域更薄更透明，因此它的高分辨率图像看起来相对锐利，如图3所示。头部及中间躯干的区域更厚，在选择的物镜下可能会模糊（图4）。这是因为只有当样本部分处于物镜的景深（DOF）之内时，图像才能对焦准确。

表2 A/B显示了系统支持物镜的景深计算值列表（对于大照相机和470 nm的透射光模式蓝色LED）。

例如，在图4中，10倍物镜的景深是2.7 μm，而位于景深之外的样本部分就会显得模糊。尽管如此，你可以读出焦平面的Z值，并计算出两眼之间的近似距离为250 μm×1.4 ≈ 350 μm。系数1.4是幼虫头部材料折射率的假定平均值。在今后的研究中，我们将研究系统的自动3D去卷积模块的应用，以改善高分辨率斑马鱼图像中的切片和去模糊。

图4. 利用透射光对斑马鱼头部所拍摄的三张Z叠加图像。10倍物镜、96孔板的说明见图1。特意选择头部轻微翘起的幼虫，这样就能看见上部和下部眼睛区域的切片。绿色的虚线图能协助区分眼睛的边界。

小结

 IN Cell Analyzer 2000能用于荧光和透射光模式下，对板中斑马鱼进行自动成像。
 系统的大CCD照相机在2倍物镜下能捕获7.6×7.6 mm2 的视场。这能够对96孔板进行快速的单图像全孔成像。
 2倍物镜有着约3.4 μm的横向分辨率，远远超过从小斑马鱼器官中捕获细节的需要，比如其心脏大小约为300 μm。
 更高分辨率的全孔成像可由系统的视场重叠功能+IN Cell Investigator 1.5的自动图像拼接来实现。
 斑马鱼的三维特征可通过自动Z叠加来研究。

结论

 IN Cell Analyzer 2000能够对斑马鱼模式生物进行全自动且连续的高内涵成像。

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