专访贺竹梅研究组：表观基因组学研究

　　

生物通报道：表观遗传学和基因组学研究都是近年来十分热门的研究方向， 随着基因组学的发展，表观遗传学的研究也开启了一个新的研究领域：表观基因组学研究。这一研究领域利用新一代测序平台为基础，结合经典的表观遗传学方法，分析各种表观遗传修饰。近期来自中山大学生命科学学院的研究人员，与深圳华大基因合作，利用基因组DNA甲基化检测黄金方法Bisulfite Sequencing (BS-Seq)，对黄曲霉全基因组DNA甲基化进行了测序，首次证明黄曲霉是一种缺乏DNA甲基化的生物（http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0030349）。

   这是在世界上第一次使用黄金标准方法—Bisulfite Sequencing研究曲霉属真菌全基因组DNA甲基化状态的报道，也是第三种被证实的缺乏DNA甲基化的生物（前两种分别是果蝇和面粉甲虫）。为了更深入的了解这一重要的表观基因组学研究成果，生物通特联系了中山大学贺竹梅教授研究组，就读者感兴趣的问题请教了贺竹梅教授和他的研究生林剑青同学。

什么是BS-Seq测序方法？

   这项研究采用了目前公认的基因组DNA甲基化检测黄金方法――BS-Seq测序方法，对黄曲霉全基因组DNA甲基化进行了测序，并从基因进化和基因组序列差异的角度对黄曲霉缺乏DNA甲基化的机制进行了分析，那么这种测序方法具有哪些优点呢？研究组为何选择了这种方法呢？

   林剑青同学表示，“Bisulfite处理测序是目前公认的对DNA甲基化状态进行分析的黄金标准。其原理是，对DNA进行Bisulfite处理之后，DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的C则保持不变。对处理转化之后的产物进行高通量测序，并与未经Bisulfite处理的原始基因组序列进行分析比较，从而获得整个基因组DNA甲基化状态的信息。

   这是一种覆盖度、分辨率、可靠性都很高的方法，理论上可以获得整个基因组上每一个C位点的甲基化信息。在本研究中，我们使用的是基于新一代测序技术Bisulfite处理测序技术路线。相比较，之前基于Sanger测序平台Bisulfite处理测序方法，需要大量的克隆测序，繁琐费时并且价格昂贵，因此，这种方法仅仅被用于研究局部区域的DNA甲基化，而不能用于全基因组DNA甲基化研究。其次，使用新一代测序平台之后，Bisulfite处理测序不再需要像基于Sanger测序平台Bisulfite处理测序一样设计大量的扩增引物和进行大量的PCR扩增，而仅需要在打断的DNA片段两端连接上测序引物即可上机测序，而该引物同时也作为DNA样品的扩增引物，其作用就相当于在DNA样品中加入任意扩增引物，避免繁琐的扩增引物设计和PCR扩增工作。”

   表观遗传学是目前生命科学研究的前沿，不仅仅在真菌，其在动物发育、植物育种、人类健康等方面的研究也得到很多科学家的关注，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、microRNA等多个方面， 贺教授实验室这几年重点关注了真菌的DNA甲基化现象。

   经过多年的发展，目前世界上研究DNA甲基化的技术手段已经相对比较成熟，从比较简单的DNA甲基化敏感内切酶、甲基化敏感特异性PCR扩增、HPLC、2D-TLC，到比较先进的甲基化芯片的应用以及在这项研究中所使用的基于新一代测序技术的Bisulfite处理测序[1,2]。

   林剑青说，“我们在前期的研究中通过DNA甲基化敏感内切酶、甲基化敏感特异性PCR扩增等方法已经发现黄曲霉DNA甲基化水平极端低，在这种情况下，需要使用一种准确度和敏感性比较高的研究方法，在整个基因组的范围内对每一个C位点的甲基化状态进行研究，使我们的研究结果更有说服力。因此，基于新一代测序技术的Bisulfite处理测序技术成了我们的选择。”

黄曲霉毒素合成代谢，黄曲霉生殖与DNA甲基化的关联

   黄曲霉因其产生强致癌物黄曲霉毒素而引起科学家的重视，黄曲霉毒素合成代谢调控的研究已成为微生物次生代谢调控机制的模型。关于曲霉属（Aspergillus）真菌的DNA甲基化问题，已经困扰科研工作者多年，从上世纪80年代初开始，科学家对曲霉属真菌的DNA甲基化及其对真菌生长和代谢的影响进行了各种研究。

   贺教授研究组前期曾采用一种广泛应用于表观遗传学和肿瘤生物学及真菌次生代谢物研究的DNA甲基转移酶抑制剂5－氮杂胞苷（5-AC）对黄曲霉毒素代谢的影响进行了研究，发现5-AC可以诱导黄曲霉产生绒毛状性状，同时可以抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素的能力。

   因此研究人员推测黄曲霉毒素的合成代谢与DNA甲基化存在一定的关联，并由此设想，如果能发现一些与DNA甲基化相关的细胞因子，那么就有可能发现能用于黄曲霉毒素代谢的调控因子，从而使我们对黄曲霉毒素代谢的机理有新的认识并为发展黄曲霉毒素控制技术提供新的思路。

   “但进一步的研究让我们有点失望，黄曲霉基因组缺乏DNA甲基化，这也使得我们不得不转变对黄曲霉毒素代谢研究的思路”，贺教授说，“从目前的研究来看，黄曲霉毒素的合成代谢与DNA甲基化调控无关。由于黄曲霉毒素的合成代谢是一个相当复杂的事件，虽然其主要的代谢通路已经明确，但许多细节及代谢基因簇以外的基因的作用、环境的影响及其他表观遗传的调控还是一个黑洞。”

   除此之外，在另一方面，长期以来，科学家们都认为黄曲霉是一种不具有有性生殖的生物，直到2009年，黄曲霉被发现是具有有性生殖的[3]。但是，在大部分情况下，黄曲霉还是以无性的方式进行生殖。生物的DNA甲基化在有性生殖过程中起着沉默转座子以维护基因组稳定的重要作用[4]。现存的单细胞真核生物主要是无性生殖的，因此，缺失通过DNA甲基化沉默转座子的能力很可能更有利于物种的适当进化。

   贺教授说，“结合我们的研究结果，我们推测，对于黄曲霉这种主要以无性生殖方式繁殖的生物，DNA甲基化的缺失可能更利于物种的进化，在黄曲霉中DNA甲基化可能仅仅存在于其有性生殖的短暂瞬间[2]”。“除了生殖方式，目前尚无证据表明DNA甲基化缺失的状态与黄曲霉的其他生活习性或者毒性有直接的关系，这也是我们的一个意外，还需要更多的研究。”

真菌DNA甲基化研究未来发展

   真菌表观遗传学吸引了不少科学家们的关注，当谈到这一领域未来的发展的时候，贺教授表示，“在基础研究方面，与动植物相比，真菌这一生物群体的DNA甲基化水平和甲基化分布尤其特殊，因此，DNA甲基化或其他表观遗传变异在真菌次生代谢、环境适应以及真菌进化中所扮演的角色，将成为未来真菌表观遗传学研究的趋势。

   在应用方面，如何通过DNA甲基化或其他表观遗传方面的改造，使真菌产生更多的能为人类所利用的代谢物同时抑制有害代谢物的产生，将成为科学家们关注的热点。虽然黄曲霉毒素代谢中存在DNA甲基化调控的可能性不大，但其他表观遗传变异如组蛋白修饰、小分子RNA作用等的调控作用是值得深入研究的。”

下一步计划

   我们目前的研究已经发现黄曲霉是一种缺乏DNA甲基化的物种，因此，DNA甲基化与黄曲霉毒素合成代谢存在直接联系的可能性比较小。然而，确实有一些证据表明黄曲霉在表观遗传层面对黄曲霉毒素生物合成过程具有调控作用。

   因此贺教授下一步将通过各种技术手段，进一步探究各种表观遗传现象如组蛋白修饰、microRNA等在黄曲霉毒素代谢中所扮演的角色。

   贺教授说，“我们实验室在上一个国家基金的资助下对黄曲霉毒素代谢与胞内氧化应激的关联进行了研究，也发现了一些有趣的现象，我们也将会在基因组层面如利用转录组学方法等继续对黄曲霉毒素代谢调控的机制作进一步的探索。”

了解贺竹梅教授更多信息，可能登录其博客：http://blog.sina.com.cn/geneticshezhumei
（生物通：王蕾）

参考文献：
1. Dahl C, Guldberg P (2003) DNA methylation analysis techniques. Biogerontology 4: 233-250.
2. Liu SY, Lin JQ, Wu HL, Wang CC, Huang SJ, et al. (2012) Bisulfite Sequencing Reveals That Aspergillus flavus Holds a Hollow in DNA Methylation. Plos One 7: e30349.
3. Horn BW, Moore GG, Carbone I (2009) Sexual reproduction in Aspergillus flavus. Mycologia 101: 423-429.
4. Zemach A, Zilberman D (2010) Evolution of Eukaryotic DNA Methylation and the Pursuit of Safer Sex. Current Biology 20: R780-R785.

贺竹梅教授实验室简介：
贺竹梅教授的主要研究领域为微生物代谢与食品安全。其实验室致力的目标为利用基因组信息、现代遗传学技术、现代微生物学技术和分析化学技术等研究黄曲霉毒素合成代谢的分子遗传学和开发黄曲霉毒素生物控制技术。贺竹梅教授著有《现代遗传学教程》（第2版）（高等教育出版社，2011）等多部著作。

主要研究领域：
1、黄曲霉毒素合成代谢的分子遗传学研究
    对Aspergillus flavus和A. parasiticus黄曲霉毒素生物合成的遗传学研究导致了黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF)生物合成路径中25个基因的克隆及发现，人们同时也发现营养因素(碳、脂、氮源和微量营养素)和环境因素(温度、pH、宿主植物的挥发物)也影响黄曲霉毒素的形成。黄曲霉毒素的代谢过程是异常复杂的，人们对参与黄曲霉毒素代谢的许多基因和代谢机制还不甚了解。因此，深入理解黄曲霉毒素的分子代谢过程及影响因子对于发展有效控制黄曲霉毒素污染的技术有着重要的意义。
   为此，贺教授实验室建立了一套黄曲霉基因组研究的方法包括遗传转化、发现新的筛选标记、转化子的快速筛选、基因敲除等（有关论文发表在BMC Microbiology，2007）。在对被敲除黄曲霉菌中一EST序列的突变菌株的研究中发现，该序列与其黄曲霉毒素代谢存在正相关性，目前正在对该基因的功能进行研究。通过对黄曲霉全基因组DNA甲基化的测序，发现黄曲霉缺乏DNA甲基化（PLoS ONE, 2012）。近期的研究更显示，黄曲霉毒素代谢与细胞内氧化应激系统存在密切关系。该实验室目前的研究兴趣之一是全面了解黄曲霉毒素代谢的分子机理，包括从表型变化、代谢物变化、基因表达变化、表观基因组变化、氧化应激系统变化等方面对黄曲霉毒素代谢进行全面解析。

2、黄曲霉毒素与食品安全和生物控制技术研究
    食品安全是国家稳定和社会发展的永恒主题，是目前国家亟待解决的重大课题。我们在食品安全方面的工作重点是黄曲霉毒素与食品安全及其生物控制。黄曲霉毒素之所以受到重视，是因为黄曲霉菌毒素B1是自然界致癌性最强的物质。目前还没有发现包括人在内的任何动物对黄曲霉菌毒素的毒性有抵抗作用。因此，对黄曲霉菌毒素在食品和饲料中含量的调查和限量标准研究，及开展黄曲霉菌毒素生物控制技术研究，对国民健康水平的提高将起到积极的作用。
   贺教授实验室近年来在对水产动物及其饲料中黄曲霉毒素污染调查之后，集中对黄曲霉毒素生物控制技术进行了研究，目前已经从自然界中分离得到的多株对黄曲霉菌具有生长抑制活性或具有降解黄曲霉毒素活性的菌株，进一步的有效作用因子的分离纯化和作用机理研究正在进行中。此外，从100余种不同植物提取物中发现了一些对黄曲霉毒素的产生有强烈抑制作用的成分，进一步的研究也正在进行中。

3、真菌分子生物学与微生物育种研究
   针对真菌这一较为特殊的生物类群，以Aspergillus nidulans为模式生物，了解真菌细胞壁的构建方式和寻找与真菌细胞壁合成相关基因，通过采用基因组互补策略克隆到一新基因和数个已知功能的基因（Fungal Genetics and Biology，2007）。以白色念珠菌为模型，通过反义RNA干扰技术和CFW筛选及药物敏感性实验，已获得一批对药物敏感性显著增强的细胞壁合成缺陷突变株（Folia Microbiology, 2010）。通过诱变育种方法获得数株高酶活酱油酿造用菌种（中国酿造，2009）。