创新参选：构建载体之鉴定重组子的高效通用方法

　　

“赛默飞之生物通2012实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。
生物通将会陆续公布一些项目，以便大家分享这些创新技术。同时为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通也准备了一些精美礼品寄出，同时近期我们还将进行第二轮抽奖，以飨读者。

 

参选项目：构建载体之鉴定重组子的高效通用方法

背景：构建载体已经是生物科学研究领域的家常便饭，其进展经常是“出结果”的限速步骤。在测序之前，一般需要初步鉴定一下，这个环节往往是几家欢喜几家忧, 现在主流的鉴定方法有两种，一种是酶切，另一种是基于PCR的方法。由于现在散样测序技术的日渐成熟，从成本上考虑，已经不建议同时进行两种方法。二选一。从保真性来讲，酶切是金标准。PCR则因为插入片段污染以及非特异性扩增等原因博得“假阳性高”的恶名。然而从实验步骤和整体效率还有成本角度上考虑，PCR，特别是菌落PCR则远远胜于酶切。我想，这也是为什么国内大部分实验室都倾向PCR。

然而，不管是酶切还是PCR，最终在电泳检测的时候，判断标准都是能够切出或者P出插入片段大小的条带。而PCR的争议之处，就在于由于连接体系中插入DNA片段对后续PCR的污染以及非特异性扩增所导致的假阳性——P出了和插入片段大小相近的条带！如果，我说如果，能绕过非特异性扩增致使假阳性这个区域，PCR鉴定的保真性无疑可以和酶切相媲美了。废话不说了，请看下一板块。

方法改进：差异是鉴别的基础。 理论上，生长的克隆主要是两种，一种是载体自连，另一种则是重组质粒。我们PCR通常针对的就是其中的重组质粒，因此使用的引物一般也是插入片段的扩增引物，通过重复扩增片段时候的PCR条件，能够P出全长大小的片段，则认定为阳性，不能扩增，则为阴性。

然而，当我将PCR的扩增目标锁定为自连载体，则将不存在假阳性的干扰。具体有两种情况，一种情况就是设计一条和双酶切切去的多克隆位点匹配的引物，另外一条在多克隆位点上/下游100-500bp内，利用PRIMER 5自动搜寻另一条匹配得分最高的引物即可。在这样的情况下，只有载体自连，才能进行有效扩增，而重组质粒，则因为其中一条引物找不到匹配位点（由于是多克隆位点，所以不必担心和载体序列的错配），无法得到扩增。所以，在这种情况下，P出预期大小片段的为阴性，而未P出预期大小条带的实为阳性（重组质粒），可以成功避免操作污染等原因造成的非特异性扩增。

另外一种设计引物的方法是针对原载体已经插入较大片段的改造载体，则可以将两条引物全部设计在质粒携带的大片段上，这个引物设计可以交给罗氏在线的傻瓜式qPCR引物设计软件，引物质量非常高，扩增片段也不会长。同理，在鉴定我们构建的重组子时，能够扩增出预期大小的为载体自连，不能扩增的则为阳性，即成功插入了我们的片段。 即使经费不是问题的时候，这个方法最突出的优势就是快速而且在全世界都有通用性。

怎么讲呢？ 首先，这个方法采用的是菌落PCR，在包含菌液PCR、质粒PCR的PCR鉴定方法中是最快的。其次，PCR扩增片段可以设计的很短，按照realtime PCR设计就可，这样PCR的耗时将极大缩短，再次，对于一个骨架载体，设计一对鉴定引物，就可一劳永逸。插入片段千变万化，不变的是多克隆位点，正所谓以不变应万变。而且对于一对认证过的引物，其普遍适用性也毋庸置疑。 目前小研已经成功设计了pCMV-HA/MYC,pCDNA3.1（+），pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，pSilencer2.1，pGL4.10，pTR-TK的PCR鉴定负筛引物，并以此构建了将近200个载体，故此推荐。

结果：公布自行设计的pCDNA3.1(+)鉴定引物和鉴定成果。 温馨贴士： 1 挑克隆，挑一半，留一半，必须保证挑上，否则会因为没有模板，出现假阳性。 2 新设计的引物，进行退火温度的预实验。每次菌落PCR增设一个以原质粒为模板的对照，以验证反应体系。 3 PCR循环数15-20即可（不足1h完成）。 4 对此，可以购买国产taq DNA聚合酶的预混加染料2倍mix，加入引物和水补足体系，可以制作成针对某骨架载体的PCR预制反应液。整个流程，从我拿到过夜培养的细菌板子，到鉴定完毕，午饭前即可完成（10个板子左右）不信？您试试！

 

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