2012回顾：PCR技术的效力与进展

　　

生物通报道  自近30年前PCR技术推出以来，其已成为分子生物学的一项基本实验室技术。最初只需要少数几种试剂、一个热源和手动热循环计时，自那时起PCR技术推动了一个行业：自动化和改善热循环，开发实时定量检测扩增反应的仪器，以及提高聚合酶的性能。

与此同时，研究人员对原始的PCR方法进行了大量改良，将它们投入多种不同的应用，例如克隆、染色体步移、基因分型和文库构建等等。尽管有许多的PCR方法已经上市，我们仍然常常会看到一些新技术，旨在解决一些新问题，或是对现有的实验方案提出一些修改。

在此，生物通的编辑特别向读者推荐两种2012年发布的PCR新技术：一种可用于基因表达链特异性扩增的新RT-PCR技术，以及另一种可更快速鉴别细菌毒力基因的PCR筛选方法。这两种方法展现了PCR技术的效力和进展。

Technique for strand-specific gene-expression analysis and monitoring of primer-independent cDNA synthesis in reverse transcription

Lin Feng, Susanna Lintula, Tho Huu Ho, Maria Anastasina, Annukka Paju, Caj Haglund, Ulf-Håkan Stenman, Kristina Hotakainen, Arto Orpana, Denis Kainov, and Jakob Stenman,BioTechniques, Vol. 52, No. 4, April 2012, pp. 263–270

多年来我们一直知道，基因表达是借助DNA结构和结合调控序列的蛋白质进行调控。近年来的研究还证实反义转录物和非编码RNAs在基因调控中起重要作用。事实上，RNA-seq等技术正在提高我们对于细胞中存在的多种RNA转录物的基本认识。这些发现使得人们兴趣日增，想要了解双向转录，并在测量细胞内的链特异性转录物水平时对它进行补偿。

以其灵敏性，RT-PCR能够检测以低拷贝数存在的核酸，因而特别具有吸引力。然而，对于那些变异被认为来自反转录步骤的检测，特异性可能是一个问题。研究人员通过随机引物和oligo(dT)引物比较特异性启动效应，但PCR的成功率似乎主要依赖于模板。引物非依赖性的逆转录使得链特异性检测变得复杂，导致很大一部分的PCR产物来自非期望的链。

今年的4月，Feng等介绍了一种链特异性RT-PCR方法，其逆转录引物采用胞嘧啶或鸟嘌呤替代了4-7个腺嘌呤或胸腺嘧啶（反之亦然），导致生成的PCR扩增子的熔化温度发生了3-5℃的改变。在基因特异性qPCR和熔解曲线分析后进行反转录。链特异性的诀窍在于所有引物启动（primer-initiated ，生物通译）cDNA转录物的序列改变，这使得利用溶解曲线分析可以定量区分引物启动和非特异性引物依赖的转录物。Feng和同事们通过定量细胞培养物中流感病毒复制过程中PB2基因的正负链证实了这一点。最终，这种新方法将获得证明，适用于研究人员精确定量链特异性mRNA表达。

PCR-based screening of targeted mutants for the fast and simultaneous identification of bacterial virulence factors

Ana Henriques, Filipe Carvalho, Rita Pombinho, Olga Reis, Sandra Sousa, and Didier Cabanes, BioTechniques Rapid Dispatches, doi:10.2144/000113906

一种病原体能够成功感染宿主，取决于变异的数量。确定这些关键的致病因子是公众关注的健康问题之一，然而由于昂贵或复杂的方法需要训练有素的人员、专用设施或大量测试动物模型，让这样的研究努力受到阻滞。采用定向或随机基因破坏策略生成突变株，在单个宿主动物中分析其表型，通过这种方法可以寻找致病因子。然而，这种方法需要许多的动物，且在靶基因的大小或特异性方面做出了舍弃。

为了能提供一种替代方案，允许在数量减少的动物中研究特异性靶向基因，Henriques等设计了一种PCR方法进行毒力筛查，对来自病菌库的单个突变株进行相对定量。作者们首先培养了单个的标记细菌突变株（插入或缺失突变），随后，以相等份量混合突变株，将它们接种到一组小鼠体内。在感染后，研究人员从小鼠脾脏和肝脏中重新获得细菌，利用精心设计的引物，采用常规菌落PCR(colony PCR)方法计算每种突变株的相对丰度。这种新方法能够轻易地区分来自重新获得的细菌库的减毒突变株，证实用PCR筛查混合突变株是一种快速灵敏的方法，初步确定致病因子，同时大大减少了所需时间和动物数量。

从我们的2012 PCR精选中可以清楚看到，PCR仍然是一种通用技术，适用于随着我们研究需求不断变化，在未来数年将可能继续发展的广泛研究。

GoTaq® Long PCR Master Mix

Promega用于扩增长片段DNA的即开即用的2×预混试剂。独特的配方使其不需优化条件即可扩增长达30kb的基因组DNA或40kb低复杂度的目的片段。热启动的DNA聚合酶，使反应体系的组装可在室温下进行。研究者只需在预混液中加入DNA模板、引物和无核酸酶的水即可组装好反应体系。提高反应特异性并最大限度的减轻研究者的负担。

（生物通：何嫱）