PCR技术年度盘点：2013年新趋势

明年是聚合酶链式反应PCR技术诞生的三十周年，这项技术为生物学，医学研究领域带来了革新性的变化，被广泛的用于传染病诊断，基因复制，遗传疾病鉴定等等方面。那么在未来一年里，PCR技术又会出现哪些方面的进步呢？

　　生物通报道：明年是聚合酶链式反应PCR技术诞生的三十周年，这项技术为生物学，医学研究领域带来了革新性的变化，被广泛的用于传染病诊断，基因复制，遗传疾病鉴定等等方面。

经过多年的发展，PCR技术越来越完备，虽然其基本程序：变性，退火，延伸并没有发生太大的改变，但是科学家们和技术人员改进了这一方法，也研发出了许多新品种PCR方法，解答了许多此前难以回答的生物学问题。从热稳定的聚合酶，到自动热循环的程序，新的数字PCR（dPCR）方法，再到可应用于高通量PCR的相关微流体设备，没有人认为PCR是一种静态的方法。

许多PCR步骤逐渐被改进，如试剂优化，引物设计优化，产量提高，扩增片段延长，保真度提高，多重反应，定量PCR的发展，这些方面的技术进步极大的拓宽了我们选择性扩增DNA的能力，为许多下游应用提供了更为精确的产物。今天，PCR广泛应用于生态，取证和食品安全等领域，同时也是分子生物学研究基础实验的重要组成元素。

那么在未来一年里，PCR技术又会出现哪些方面的进步呢？

目标更小

随着生物学家们展开了针对单细胞分子事件的探索，毫不奇怪PCR技术也朝着单分子分析方面发展。要做到这一点，反应量就需要大幅度缩减，微流体PCR系统具有精巧设计的通道，以及处理复杂进程的方法，能降低试剂的用量，加速PCR过程，并且所需的样品量也很少。

但要实现更小体积和更快循环速度，是要付出代价的：微流体PCR重复使用过程中出现了PCR效率低，受到污染等问题，降低了反应速度，还有昂贵的制造费用。不过近期的研究成果表明，早期一些错误已经被修改，这一领域在2013年将迎来新的春天。

今年4月，Pak等人发表了一种红外辐射热循环仪，以及相关的微流控芯片，用户只需简单地将芯片加到仪器上，然后在扩增后再取下来。以前的反应系统要求反复校准，热电偶插入（thermocouple insertion）和调整等步骤，省略这些要求，能令实验室中未接受工程培训的研究人员易于进行红外微流体PCR操作（1）。

除此之外，今年其它方面的重要改进也将令微流体PCR在2013年大放异彩，比如半反射（semi-reflective）的发展，在微流体装置通道上覆盖非活性铂纳米颗粒单层，这能增强非接触式温度传感的干涉信号（2），还有单细胞实时微流控PCR（3）新方法，以及几种新型特异性的，基于微流控的护理诊断试剂。

另外来自美国斯坦福医学院的研究人员还开发出了一种集成微流体电路，用于单细胞实时PCR，而且他们还利用这种设备比较了人类诱导多能干细胞(hiPSCs)和人类多能干细胞(hESCs)的异质性。它们发现相比hESCs在hiPSCs中基因表达水平差异更大，表明一种不稳定的多能状态。此外，研究小组还发现hiPSCs的分化缓慢且不一致，这有可能会不利于其临床应用。

在产品方面，Fluidigm基于其专利的微流体技术，开发了一种全新的单细胞基因表达检测方法，其核心技术在于一种微流体芯片（Integrated Fluidic Circuit, IFC）。这项技术是在1998年由加州理工学院的斯蒂芬•奎克（Stephen Quake）博士领导的研究小组发明的。

当时他们试图寻找一种方法制造能控制极少量液体的微型装置，将其整合成为一个密集的管道系统，从而将成千上万相互独立的生物化学反应集中于一个很小的区域内。最终他们使用一种称为多层软光刻（Multilayer Soft Lithography）的生产过程，应用了一种橡胶类材料，制造出最早的微流体芯片(Unger et al. 113-16)，(Thorsen, Maerkl, and Quake 580-84)。经过进一步完善，目前这项技术已被Fluidigm用于开发出了多种针对不同应用的生物芯片。包括用于单细胞捕获制备的芯片及用于单细胞基因表达的芯片等。

目前单细胞基因表达分析广泛采用了称为BioMark™ HD的微流体PCR系统，这一系统创新技术就在于集成液体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增。集成流体通路技术极大地简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，其纳升级的反应体系为高通量的基因分析应用节省大量成本（试剂用量更少，样品量更少）。

更多BioMark™ HD的微流体PCR系统技术信息>> >>

 

（生物通：张迪）

参考文献：

1.Biomed Microdevices (2012) 14:427–433(Pak et al.)

2. Lab Chip, 2012,12, 127-132

3. Nat Protoc. 2012 Apr 5;7(5):829-38.