选对你的共聚焦显微镜

生物通报道：共聚焦显微镜比宽场显微镜具有更多的优势，共聚焦显微镜可以对样品做连续光学切片并排除非焦平面的信号干扰，为此共聚焦显微镜的应用也的确更为普遍。不过市面上各种各样的共聚焦显微镜越来越多，要如何进行选择呢？在选择共聚焦显微镜时，最基本也最重要的考虑因素主要有两点：您想要研究的样本类型（如：固定的细胞还是活细胞），以及您想要进行的检测类型（如：静态还是动态细胞过程）。

固定细胞的共聚焦成像

要对固定且染色了的细胞或组织成像，我们一般选择激光扫描共聚焦（LSCM）。这主要是因为固定的死细胞缺乏活细胞中的快速生物学事件，能更好的受益于LSCM较高的空间分辨率。LSCM成像是通过激光对样品进行光学层切，扫描速度（取决于扫描阵镜速度）一般为1fps。曝光时间越长意味着光漂白的风险越大，但对于固定的死细胞，时间并不是很关键，我们可以通过拍多张图片来平均。

活细胞的共聚焦成像

成像活细胞需要额外的保护，以免不友好环境的干扰。在成像时，我们首先需要考虑的是保持细胞的活性和健康，恒温加热元件和灌流系统是必不可少的，尤其对于进行time-lapse（时间序列）的研究来说。控制活细胞生理状态的快速生化事件是大多数人最想要研究的，但这些事件对于传统LSCM来说太快了。此外，LSCM的长时间曝光还会引发毒性光照损伤细胞。因此，对活细胞进行成像会需要特殊的共聚焦显微镜。

对活细胞进行共聚焦成像一般有两个选择：快速扫描的激光扫描共聚焦和转盘共聚焦。快速扫描共聚焦显微镜用较快的共振扫描阵镜（resonant scanning mirrors）取代较慢的galvanometers mirrors，能使扫描速度达到30fps；而转盘共聚焦(SDCMs)的优势在于扫描速度更快（虽然不可避免的要损失空间分辨率），其速度理论上可达到2000fps（实际上往往受到其他因素的限制）。

如果您担心光漂白或者很弱的荧光信号，那么SDCM可能更加适合。SDCM采用两个带有阵列微孔的转盘转动来分散激发光，不同于LSCM对样品进行点扫描，SDCM一次采集多个点（大约100个像素点），因而速度大大增加，并且SDCM的光漂白及光毒性更小。不过，您也可以采用快速扫描共聚焦来提高扫描速度，配合高灵敏检测器，降低激发光能量来减少光毒性，这样能够保证传统共聚焦的丰富功能。

自动化共聚焦成像系统

一些研究者喜欢想方设法对显微镜进行改造，以适应自己的个性化需求。而有些研究者则对显微镜到底是如何工作的根本不敢兴趣。对于后者而言，一台自动化的共聚焦显微镜可能更合他们胃口。举例来说，Olympus FluoView FV10i就是这样一台全自动桌面型4激光共聚焦显微镜，其紧凑的整合结构对安装空间基本没有要求。这类仪器非常适合那些需要每天做很多图像数据采集的研究者，当然它们并不能完全体现传统共聚焦的功能及灵活扩展性。此外，Nikon A1也是一套全自动共聚焦系统。与大多数传统共聚焦扫描显微镜一样，Nikon A1采用galvanometer扫描头，其分辨率比采用混合式扫描头的A1R高，但速度稍逊（A1R约30fps）。

增加对各种共聚焦显微镜类型的了解，可以帮您找到最适用的仪器。如今，即使不考虑全自动系统，不论您选择什么机型，大多数系统都内置有丰富的人性化功能，可以使您收益匪浅。

 

编者注：

原文提到的扫描速度并没有标注对应的扫描分辨率，仅供参考，具体数据请查阅相应产品资料。

现在，共聚焦显微镜正不断向更快速、更灵敏、更高分辨率及更好的可扩展性发展，不断有新技术诞生。速度方面，有共振快速扫描头及转盘共聚焦；灵敏度方面有AOBS分光系统及更灵敏的检测器（HyD，GaAsp PMT）；分辨率方面有超高分辨率（SIM，STED， PALM，STORM）；此外还有多光子、白激光、SMD等技术。我们在选择共聚焦系统时最好能多听听各厂家的介绍，以便对这些技术有所了解，根据自己可能进行的研究选择最合适的仪器。

 

（Caitlin Smith撰写/叶予编译）