攻克多重PCR之难（上篇）

生物通报道：多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本，它需要耗费更多的时间和精力，同时也会给用户回报更丰富的数据。本文介绍了一些实验技巧和商业化工具，希望能帮您轻松获得好结果。

PCR的重要性毋庸赘述，这一诺贝尔获奖技术的普及带动了现代基因组学、鉴定技术、医疗诊断等领域的发展。如今，PCR几乎是每个实验室必备的通用技术，不过要跑好一个PCR也并非那么简单，由于PCR反应很灵敏，PCR的效果很容易受到污染和脱靶效应的影响。我们在设计PCR实验时须得将引物设计、反应条件和酶的选择一一考虑周全。这一点在多重PCR中尤为明显，因为多重PCR需要在一个管中同时检测多个目标（通常二至五个）。多重PCR应用也很广泛，可以用来做基因表达分析、SNP分型、STR分型等鉴定以及病原菌检测等等。

多重PCR的反应数相对较少，所消耗的试剂也较少，是一个颇为经济的选择。人们往往选用多重PCR来处理临床样本等珍贵样本，或者用来增加实验通量，每个样本所需的孔少了，那么一个微孔板自然就能容纳更多的样本。

多重PCR的挑战

传统PCR反应体系包括模板DNA、两个扩增引物、酶和缓冲液，一般最后通过凝胶电泳来检测所得的扩增产物。定量PCR除上述元素之外，还需要荧光探针以便检测反应的进行，不过就不需要进行凝胶电泳了。

从一般PCR到多重PCR，其实验设计的难度也随之翻倍。如果说扩增一个片段需要三条引物，那么两个片段就需要六条，三个片段需要九条，以此类推。这些引物既不能互相结合，也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外，我们还要考虑同时检测不同的扩增子，要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳，要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。更麻烦的是，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景。

上述困难都是进行多重PCR的绊脚石，“大多数人都嫌太麻烦了，”Life Tech的资深科学家Jonathan Wang说“有许多客户对多重PCR感兴趣，但遇到这些麻烦之后，他们都选择了放弃，”安捷伦公司的产品经理Laura Mason补充道。

实验设计小tips

其实假如咱们迎难而上，还是有许多工具和小窍门可以帮得上忙的。NEB的资深科学家Nicole Nichols为正在设计多重PCR反应的研究者们推荐了以下五条基本原则。

原则一A：引物设计

“引物设计这一步是没法跳过的，” Nichols说。“从一开始就好好注意细节，最终将能为你节省很多优化时间。”

她推荐引物设计得比一般稍长一点（24–35 bases），解链温度稍高一点（65 °C以上），并且GC含量控制在50–60%。当然除此以外，PCR引物设计的标准规则是肯定要遵守的：保持几对引物解链温度相似、避免互补序列、避免3’端出现超过3个连续的G或C，以及以及验证、验证、再验证。

多重定量PCR不能用SYBR Green等插入染料，探针法是唯一的选择，例如Life Tech公司的TaqMan®探针或者IDT公司的PrimeTime® 探针。Bio-Rad公司的经理Keith Cockrum建议将这些探针的解链温度设计得比扩增引物的高7–8 °C。“我们要让探针先退火，”他解释说，要不然序列就会在没有探针的情况下进行扩增，他将这种无法检测到的扩增反应称为“endogenous PCR”。“这是我们想要的特异性PCR反应，我们只是无法检测到其发光，”他解释道。

原则一B：引物验证

引物验证必不可少的步骤，Cockrum建议，首先将每对引物分别在模板上进行测试，这里的模板指对照样本，例如安捷伦公司的QPCR Reference Total RNA。可用SYBR Green熔解曲线分析引物对是否扩增出单一产物。另外还要引入温度梯度，以确定所有引物都能起作用的温度范围。如果有一对引物不能与其他引物一同起作用，她建议直接放弃这对引物重新开始设计，“放弃并重新设计其实比不断优化要好的多。”

如果要做多重定量PCR，Cockrum建议先在单重反应中测试探针，用一系列稀释度来确定每个探针的动态区域。最后再把所有元素组合到一起，确保各自的特异性、敏感性、动态区域等没有受到影响。“如果将以上都进行了论证，你就会拥有一个非常棒的多重PCR实验，”Cockrum说。

原则二：引物浓度

Nichols推荐的第二项原则是，保证每个引物浓度都低于单重PCR中的浓度，否则“反应中的总引物浓度会就会太高”。传统PCR反应中引物浓度为0.2 μM，那么我们可以试试0.15 μM（引物浓度范围通常在0.05 μM至0.4 μM之间）。

（下接：攻克多重 PCR之难下篇）