创新参选：优化的有核细胞体外分离

　　

“赛默飞之生物通2012实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。
生物通将会陆续公布一些项目，以便大家分享这些创新技术。同时为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通也准备了一些精美礼品寄出，同时近期我们还将进行第二轮抽奖，以飨读者。

参选项目：优化的有核细胞体外分离

背景： 截止目前国际国内从骨髓血、脐带血、外周血中分离提取有核细胞的方法有三类第一类是以除去红细胞的方法：如氯化铵裂解红细胞法，Percoll 非连续密度梯度离心法、Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法等，但实际操作过程还是不能完全除去红细胞，最理想的还会有1％的红细胞残留。第二类是利用细胞表面抗原性不同分离细胞的方法，如磁珠法，免疫荧光标记法，富选法，流式细胞仪等，是选择性的分离CD3、CD105、CD113、CD34 等等。这些方法所存在的共同问题是：一是不能有效保留所有类型的有核细胞或干细胞；二是分离提取的细胞种类单一，不能有效保留所有的细胞种类；三是造价太贵；四是技术条件不符合临床使用，只适用于科学研究的方法。第三类是利用细胞生长的某些特性分离细胞的方法，如间充质干细胞在培养时具有贴壁生长的特性，从而分离出间充质干细胞。

方法改进：优化的有核细胞体外分离实验方法，是由两种试剂组成，试剂1 由红细胞沉淀剂、氯化钠或氯化钾构成；试剂2 由泛影酸钠加聚蔗糖400#构成，其密度在1.076-1.090 之间。使用方法：取100ml 人类骨髓血、或脐带血或外周血，直接加入到200ml 试剂1 液体中静置10-30 分钟，收取上清液，以2000 转/ 分钟(1100xg) 的速度离心5 分钟，弃上清液，余物加入到装有试剂2 液体的离心管中，进行密度梯度离心30 分钟，转速控制在1500转/ 分，吸取有核细胞层，然后再离心清洗1 ～3次，再用50ml 细胞保养液稀释备用。

结果：本改进，降低了能耗，降低了生产成本，节省了原材料，改进了工艺。使用方法较以前更为简单，减少了操作步骤，更加方便了科研和临床使用。 1、细胞总数检测，用血球计数仪或血球计数板在显微镜下计算出细胞总数。正常100ml 骨髓血、脐带血或外周血分离提取的细胞总数不应少于5.9×107个细胞 2、细胞存活率检测，采用苔盼蓝检测法检测细胞存活率，常规细胞存活率≥98％。 3、细胞收集率检测，细胞分离前用血细胞分析仪或显微镜手工计算有核细胞总数(A)，分离后用同样的方法测定出有核细胞的总数(B)。回收率＝B/A×100％。常规细胞回收率≥90％ 4、由于用本发明所分离的有核细胞中包含成体干细胞，所以可以用流式细胞仪检测干细胞。常见干细胞的含量CD34 ≤2％，CD38 ≤1.5％，CD133 ≤1.0％等等。 5、生产制备角度来比较，节省33 ％的原料、辅料和包装材料；节省了1/3 的生产耗能。 6、方法简单了，缩短了细胞分离提取的时间，大大方便了临床和科研的使用，提高了工作效率。 7、缩短了体外分离的时间，简化了步骤能有效提高细胞存活率两个百分点，这一个百分点就是1×106个细胞，这在临床治疗中有非常重要的意义。

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