筛查肿瘤样本突变的最新利器[新品推荐]

定向重测序可用于特定基因组区域的高效测序。现有的目标富集方法耗时、复杂，通常需要大量的起始DNA。转化和临床研究需要一些快速的方法，且兼容少量富有挑战性的研究样品，如福尔马林固定、石蜡包埋的组织（FFPE）。

Ion AmpliSeq™ 技术突破了多重PCR的已知障碍，推出了一个开创性的流程，能实现数百个已知突变的快速测序及低频率等位基因的检测。利用少量的起始DNA，这个一管式流程如建立PCR反应般简单，任何实验室技术人员均可操作。检测低频率突变的卓越覆盖度，以及Torrent软件包中的按键式分析工具，让您能在一天内从提取的DNA到变异体检出。

Ion AmpliSeq™ Cancer Panel是一个仅供研究使用的产品，也是第一个依靠Ion AmpliSeq™ 技术的产品 – 内容能够完全定制的Ion AmpliSeq™ Custom Panel即将上市。

低的DNA起始量与单日的Ion AmpliSeq™流程

Ion AmpliSeq™ Cancer Panel与临床和转化研究的需求相吻合。快速、DNA起始量低的步骤实现了FFPE样品的筛选，而这些样品无法用于其他的目标富集方法。同样，不到90分钟的测序运行时间和单日流程能够快速、平行评估数百个关键突变。

在一管式多重PCR反应中利用10 ng DNA和Ion AmpliSeq™ Cancer Primer Pool扩增目标。对扩增子进行纯化和磷酸化后，继之以标准的文库制备。这让您在3.5小时内从DNA到完整的文库产生，而手工操作不到10分钟。模板制备之后是完全自动化的Ion OneTouch™ 系统。在Ion PGM™ 系统上开展不到90分钟的测序运行后，结果即可用于分析。从DNA到变异体检出的整个Ion AmpliSeq™ 流程仅需一天，且伴随着无人值守的测序和数据分析。Torrent软件包检出的变异体可通过标准的网页浏览器在远程查看。

Ion AmpliSeq™ Cancer Panel带来的关键基因区域的完整覆盖

有了Ion AmpliSeq™ Cancer Panel，Ion PGM™ 系统将肿瘤研究转化成一管式分析，让低频率突变能够准确经济地检测。Ion AmpliSeq™ Cancer Panel覆盖了46个癌基因的相关区域。与杰出的肿瘤学家和癌症研究人员共同设计，单管的引物池实现了关键癌基因中所有目标突变的极佳覆盖，包括肿瘤抑制基因和癌基因。表1列出了Ion AmpliSeq™ Caner Panel的典型覆盖。

表1. Ion AmpliSeq™ Caner Panel的典型覆盖。

覆盖深度	>100×	>500×	平均覆盖深度
所有突变	96.4%	88.1%	2,107×
KRAS、BRAF和EGFR的突变	98.7%	94.1%	2,379×

低频率突变的高灵敏度检测

从FFPE样品中提取出基因组DNA。用Qubit® 荧光计和Qubit® dsDNA HS Assay Kit定量提取出的DNA。随后利用Ion AmpliSeq™ Cancer Panel和Ion PGM™测序仪对样品进行测序。使用10 ng FFPE DNA，根据Ion AmpliSeq™ 文库制备的用户指南处理样品。制备模板后，在Ion PGM™ 测序仪上利用Ion 314™芯片对每个样品的扩增子文库进行测序。

考虑到Ion PGM™ 系统的准确性和Ion AmpliSeq™ 技术的灵敏度，各种样品中通过Ion AmpliSeq™ Cancer Panel靶定扩增子的基线噪音水平非常低（表2）。这就为混杂群体中利用Ion AmpliSeq™ Cancer Panel的低频率等位基因检测带来了高的置信度。

图1显示了一个MET基因的扩增子，第61位的等位基因突变频率为5.32%。这凸显了Ion PGM™ 系统及Ion AmpliSeq™ Cancer Panel的灵敏度和准确性。此突变是在3,426倍覆盖度下检测的，平均基线噪音水平为0.32%。Ion PGM™ 系统的高水平准确性和高覆盖深度实现了混杂样品中低频率突变的可靠检测，且置信度高。

表2. 利用Ion AmpliSeq™ Cancer Panel的基线噪音水平。

样品	基线噪音水平（所有扩增子）	碱性噪音水平（KRAS、BRAF和EGFR扩增子）
细胞系样品	0.43%	0.40%
FFPE扁桃体对照样品	0.41%	0.40%

图1. 利用Ion AmpliSeq™ Cancer Panel的低频率等位基因检测。

按键式变异体分析工具

数据可利用Torrent软件包（TSS，版本1.5）进行分析，此软件特有Ion AmpliSeq™ 癌症变异体检出插件。此插件是特别为Ion AmpliSeq™ Cancer Panel设计和优化的，可鉴定目标位点上739个已知突变，并提供每个等位基因检出的等位基因频率和置信值。通过第三方软件工具可实现更多的分析选择，包括目标区域中新突变的鉴定和查看，这些工具使用Ion PGM™ 系统的标准输出文件（如BAM、VCF）。

castPCR™ 技术的确认

对于Ion AmpliSeq™ Cancer Panel所覆盖的KRAS、BRAF和EGFR突变的确认，Life Technologies提供了44个TaqMan® Mutation Detection Assay，它们是由castPCR™ 技术支持的。castPCR™ 技术利用竞争性等位基因特异的TaqMan® PCR进行突变检测，检测极限达1-5个拷贝。这些检测具有极佳的灵敏度（0.1%）和特异性（>99.9%），能检测并定量混合样品中极少量的突变DNA。

高的流程重复性

Ion AmpliSeq™ 流程所获得重复性非常高。我们利用Ion AmpliSeq™ Cancer Panel处理5个重复的AcroMetrix® KRAS FFPE对照样品，并在Ion PGM™ 测序仪上进行测序，每个重复样品使用10 ng DNA。所有样品运行的平均相关系数为0.99989。

Ion AmpliSeq™ 的扩展性

尽管Ion AmpliSeq™ Cancer Panel利用单支含有190个引物对的管，但这种方法还可完全扩展，不断增加每支管中的引物对数量。图2显示了一个定制Ion AmpliSeq™设计的性能，单支管中有480个引物对。关于Ion AmpliSeq™ Custom Panel的更多信息，请访问Ion社区（www.iontorrent.com/community）。

简单的Ion AmpliSeq™ 流程可轻松改变，以容纳多支引物池管，每支仅使用10 ng DNA。例如，8支管（每支有480个引物对）需要80 ng DNA，总共有3,840个引物对。此外，操作步骤可优化，便于96孔或384孔板的手工或自动处理。

Ion Torrent的多种芯片产量为样品处理和实验设计提供了高的灵活性。Ion 314™ 芯片的产量允许对Ion AmpliSeq™ Cancer Panel的一个样品进行经济的处理，而每块芯片只需99美元。Ion 314™ 芯片的至少300,000个读取为KRAS、BRAF和EGFR中超过90%的位点带来了500倍以上的覆盖度，而所有目标突变的平均覆盖深度一般超过2,000倍（表1）。这种覆盖度水平能够准确检测5%频率的等位基因，而置信水平为99%。Ion 316™芯片和Ion 318™芯片*的更高通量，再加上Ion DNA条形码试剂盒，能实现体细胞和生殖系突变检测中的多重分析。预计在未来几个月内系统准确性不断提高，则样品也可在Ion 316™芯片或Ion 318™芯片*上运行，其不断增加的覆盖深度（超过1,000倍）可检测极低频率的等位基因。

图2. Ion AmpliSeq™ custom panel的设计，利用单支管中的480个引物对。

结论
Ion AmpliSeq™ 技术是目前生成目标区域文库的最快、最简单方法。一管式分析如建立PCR反应般简单，能产生最多480个扩增子。Ion AmpliSeq™ Cancer Panel能够在一天内鉴定出46个关键癌基因的数百个突变，且有着高灵敏度和高准确性，仅利用单管多重PCR反应和10 ng DNA。

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