无需DNA纯化即可进行植物基因分型和转基因检测[创新技巧]

作者：Pia Kuusisto & Pak Yang Chum, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland

关键词
• 直接PCR
• 基因分型
• 转基因检测
• 拟南芥
• 非洲菊
• dCAPS

摘要
Thermo Scientific Phire植物组织直接PCR试剂盒能够直接从各种植物组织中扩增DNA。这里介绍了用该试剂盒进行植物基因分型和转基因检测的实验步骤，该操作在PCR前无需纯化DNA，从而既节约了时间，又节省了费用。在本应用指南中， 使用的是Thermo Scientific Piko热循环仪和UTW PCR管，从而在最短的时间内获得最佳的结果。

简介
基于PCR的目标DNA检测在植物研究中有着多种应用，如植物基因型分析和RNAi转基因的验证。植物组织的PCR通常包括最初的DNA提取纯化步骤，这可能需要昂贵或有毒的试剂，不仅耗时，还有交叉污染的风险。1,2 而使用Phire® 植物组织直接PCR试剂盒，无需预先提取DNA，即可轻松检测目标DNA。

在此，我们对转基因非洲菊进行了检测，无需DNA的提取纯化，直接以非洲菊的叶片或花瓣组织为模板即可进行转基因（或RANi载体）的检测。另外，还可以利用拟南芥植物叶片直接开展酶切扩增序列多态性分析（dCAPS）实验。

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材料与方法
• Phire植物组织直接PCR试剂盒
• Ssp I（New England Biolabs）
• 24孔Piko热循环仪
• Piko® PCR板
• 非洲菊和拟南芥组织

非洲菊叶片和花瓣组织：
直接步骤：利用Harris Uni-Core™（包含在试剂盒内）从植物叶片上打一个0.50 mm的小孔。直接将样品放在20 μl PCR反应体系内。利用24孔Piko热循环仪和Piko PCR反应板进行反应。生成的PCR产物在琼脂糖凝胶上分析。

拟南芥叶片：
直接步骤：利用Harris Uni-Core从植物叶片上打一个0.50 mm的小孔。直接将样品放在50 μl PCR反应体系内。利用24孔Piko热循环仪和Piko PCR反应板进行反应。

限制性酶切消化：PCR完成后，短暂离心，取上清加入Ssp I进行限制性酶切消化反应。生成的片段进行凝胶电泳分析。

注意：植物组织直接PCR，由于PCR产物既包括了植物组织又含有PCR衍生组分，这些有可能会干扰限制性酶切消化。因此，必要时需在在随后的消化前对PCR产物进行稀释（如用水进行1:2或1:3稀释）或纯化。

表1：PCR的反应条件

组分	20 μl反应	50 μl反应	终浓度
水	加至20 μl	加至50 μl
2× Phire植物组织PCR缓冲液	10 μl	25 μl	1×
引物A	x μl	x μl	0.5 μM
引物B	x μl	x μl	0.5 μM
Phire 热启动II DNA聚合酶	0.4 μl	1 μl
植物组织	0.5 mm小孔	0.5 mm小孔

表2：循环条件

	3步法
循环步骤	温度	时间	循环数
起始变性	98°C	5分钟	1
变性 退火 延伸	98°C X °C 72°C	5秒 - 20秒	40
最终延伸	72°C 4°C	1分钟 保持	1

结果与讨论
在本应用指南中，我们介绍了Phire植物组织直接PCR试剂盒在两种目标DNA检测方法上的性能。首先，无需提取纯化DNA模板，直接以植物组织即可轻松检测到非洲菊中的RNAi载体（图1）。我们检测了12株非洲菊，直接将0.50 mm的叶片或花瓣组织放在PCR反应体系中。以RNAi转基因特异引物进行扩增，其中5株植物得到了阳性结果，表明RNAi载体的存在。该结果得到了传统DNA抽提方法（CTAB法）的证实（数据未显示）。样品材料还用试剂盒中附带的对照引物进行了检测，以确保试剂和样品处于良好的状态（数据未显示）。

接下来，我们检测了Phire植物组织直接PCR试剂盒在dCAPS基因分型上的性能。在dCAPS基因分型分析中，通过SNP等位基因中特异的限制性内切酶位点来消化鉴定单核苷酸多态性（SNP）。该方法首先利用与目标DNA有着一个或多个错配碱基的引物，通过PCR引入（或破坏）目的SNP中的限制性酶切位点。而后对PCR产物进行酶切消化，在琼脂糖凝胶中分析生成的片段，进而判断每个个体的基因型。

在本实验中，利用Phire植物组织直接PCR试剂盒以植物叶片为模板扩增了拟南芥基因组中的目的SNP位点。正向引物的3’端引入了一个错配碱基，从而在包含目的SNP（A-等位基因）的目标DNA中创建了一个Ssp I特异性酶切位点，而包含目的SNP的另一等位基因则没有（图2）。注意，即使Phire 热启动II DNA聚合酶仅有非常温和的3’-5’核酸外切酶活性是，也有必要在正向引物的3’端用3’端硫代磷酸（PTO）进行修饰。

在PCR反应混合液中直接用Ssp I消化PCR产物。琼脂糖凝胶分析显示出高产量的消化产物。这个结果证实在使用Phire植物组织直接PCR试剂盒进行dCAPS基因分型前，无需DNA纯化。

图1. 利用Thermo Scientific直接PCR方法检测非洲菊中的RNAi载体。来自植物叶片或花瓣组织的小孔样本（0.50 mm）直接放在20 μl PCR反应中。利用转基因特异的引物扩增210 bp的产物。结果显示，对应于2、4、7、9和11样本的植物个体包含了RNAi转基因。所获结果经CTAB DNA提取加PCR扩增的传统方法进行了证实。

 

图2. 用dCAPS技术对拟南芥植物进行基因分型。来自植物叶片的0.50 mm小孔样本直接放在50 μl PCR反应中。利用可以向A-等位基因引入一个独特的Ssp I位点的引物扩增出160 bp的PCR产物，产物中包含SNP位点（G或A等位基因）。用Ssp I限制性酶消化未纯化的PCR产物。在3%的琼脂糖凝胶上分析生成的片段。M，分子量标准；A和G对应每个样品的SNP等位基因。所获结果经DNA提取加PCR扩增和限制性酶切消化的传统方法进行了证实。

致谢
非洲菊样本和相关的PCR引物是由赫尔辛基大学农业科学系非洲菊实验室的Paula Elomaa教授及其研究小组馈赠的。对于拟南芥样本和相关的PCR引物，我们要感谢赫尔辛基大学植物生物学植物应激组的Jaakko Kangasjärvi教授及其研究小组。利用传统方法进行的实验是由Anneke Rijpkema博士和Airi Lamminmäki夫人开展的。

参考文献
1. Doyle, J.J. and Doyle, J.L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19 (1): 11-15.

2. Kim, C.S. et al. 1997. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP. Nucleic Acids Research 25 (5): 1085-1086.

3. Neff, M.M. et al. 1998. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. The Plant Journal 14(3):387-392.

疑难解答
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（赛默飞世尔科技供稿，生物通翻译。）