细胞核重编程：从克隆青蛙到诱导多能干（iPS）细胞[综述]

三个独立的小组（包括山中伸弥）采用筛选基因的方法，产生了三种iPS细胞。通过全局基因表达模式和嵌合体分析，这三种细胞本质上非常接近小鼠胚胎干细胞。这种无需使用人体胚胎就能形成患者特异的多能干细胞的优势不言而喻，因而引起了研究人员极大的兴趣。

早在20世纪50年代，我们通过John Gurdon等人的实验就已经得知卵细胞质能重编程体细胞核。1这些实验是为了解决分化细胞的基因组是否经历了不可逆转的变化，以及是否不再支持早期发育这些问题而进行的。Gurdon的实验表明并非如此，蝌蚪的分化细胞的细胞核在移植进入卵母细胞质中后，能指导卵细胞发育为性成熟成体青蛙。2尽管发生在50年前的重组DNA前时代，这些早期的核转移或克隆实验还是引起了报刊上关于克隆人可能性的猜测。1

几乎在同一时期，McCullough和Till证实了单个的骨髓来源细胞能产生多种造血细胞类型，3这是干细胞领域的重大发现。二十年后，发现了能产生成体小鼠所有组织类型的胚胎干细胞（ES）。4,5 细胞核转移和干细胞这两个各自迷人的领域，在2006年发生了非常引人注目的碰撞。一些重大的发现为这次事件铺平了道路。正如两栖动物中一样，细胞核移植进入小鼠卵母细胞后表明体细胞核重编程成为多能状态。6Tada等发现不止是卵细胞质，胚胎干细胞质在核移植细胞融合后也能重编程体细胞核。7发育生物学的研究随后鉴定了一组在胚胎干细胞和其他多能细胞类型特异表达的基因，这些基因可以认为是决定细胞多能状态的候选基因。8

 

图1. 细胞核重编程

A．在20世纪50年代，发育生物学家着手做实验来研究细胞分化是否涉及DNA水平的永久改变。如果是这样，他们推断，分化细胞的细胞核即使是放置在早期发育环境如卵中，也不能够指导早期胚胎发育。这些实验也被称为体细胞核转移（SCNT）或克隆。实际上，蝌蚪的肠细胞核在置于摘除细胞核的青蛙卵母细胞中时，能够支持整个发育过程直至形成一个成熟的青蛙。这个过程，也就是卵细胞质中存在的因子改变了基因表达的模式，将已分化的细胞核转变成为未分化细胞核的过程，称之为重编程。其中涉及的改变是表观遗传的，包括DNA甲基化的改变、组蛋白修饰和染色质结构。

B．后来，将成体卵丘细胞的核注入去核的小鼠卵母细胞产生了克隆小鼠。如同青蛙实验一样，卵丘细胞核重编程成为多能状态，能支持完整的发育。

C．重要的是，重编程体细胞核的能力不仅仅限于卵细胞质，如成体小鼠胸腺细胞与胚胎干细胞融合实验所示。尽管重编程不完全，但体细胞核中存在的Oct-3/4绿色荧光蛋白（GFP）在杂交细胞中表达，而在未融合的亲代胸腺细胞中不表达。

通过确定的细胞因子诱导细胞多能性

在2006年，Takahashi和Yamanaka推断胚胎干细胞特异的基因产物或许可以替代胚胎干细胞质，重编程体细胞核返回多能状态。为了验证这个假说，他们利用反转录病毒表达载体在体细胞内过表达24个候选基因。9为了确保罕见的重编程事件能被检测到，他们开发了一种分析系统，其中胚胎干细胞/早期胚胎特异的Fbx15基因激活将使细胞产生抗药性。起始的体细胞群（小鼠胚胎成纤维细胞，MEF）因为Fbx15基因不表达，药物筛选杀死了全部细胞。接着他们向小鼠胚胎成纤维细胞中分别转导了24个候选基因，还是没有获得具抗药性的细胞。然而，当24个候选基因一起转导，研究人员确实分离到了具抗药性的细胞克隆。其中某些克隆表现出与胚胎干细胞类似的形态和增殖特征。进一步分析证实了它们丧失了成纤维细胞特异的基因表达，而获得了胚胎干细胞标志物基因的表达，包括Oct-3/4、Nanog、Cripto、Dax1和FGF4。通过挨个抽离24个因子中的单个因子，他们最后鉴定出克隆形成必需的10个因子。第二轮又从这10个因子中逐个抽出单个因子，最终将必需因子的范围缩小至4个：Oct-3/4、KLF4、SOX2和c-Myc。Takahashi和Yamanaka将这些细胞命名为iPS细胞，即诱导多能干细胞。为了检验这些细胞在功能上是否具有多能性，他们将iPS细胞皮下注射入裸鼠来产生畸胎瘤。一般来说，细胞形成的畸胎瘤形成具全部三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）特征的组织被认为是细胞多能性的可靠分析。4种因子诱导产生的大多数iPS细胞表现出了此种多能性。然而，小鼠系统中多能性的最终明确鉴定是：将这些细胞注入小鼠囊胚中，能形成包含正常胚胎所有组织的嵌合体。在这些独创的iPS细胞的嵌合体分析中，在胚胎第13天可发现具备iPS发展出来的三个胚层组织的胚胎。但是，没有获得存活的嵌合体小鼠。

这篇里程碑式的论文让学术界为之振奋，同时也引发了一些有趣的问题。例如，作者根据基因表达分析和嵌合体分析中的行为断定iPS细胞类似但不等同于胚胎干细胞。那么这两种细胞类型的关系是什么呢？另一个问题有关获得iPS克隆的低频率，提出了一种可能性——稀有的成体干细胞是唯一一种能诱导成更多多能性状态的细胞。尽管他们观察到从富集较多成体干细胞的细胞群如小鼠骨髓基质获得iPS诱导频率与原来相仿，这显然与该模型相悖，但他们的文章并没有解决这个问题。9

产生与胚胎干细胞更加类似的iPS细胞的关键是改变筛选基因。三个独立的小组（包括山中伸弥）采用这种方法，产生了三种iPS细胞。通过全局基因表达模式和嵌合体分析，这三种细胞本质上非常接近小鼠胚胎干细胞。10-12 Okita等利用Nanog的激活来取代Fbx15作为筛选标记，推测筛选更严谨的标准应该是激活多能性的必需基因（Nanog），而不是非必需基因（Fbx15）。10与Fbx15表达选择的iPS细胞相比，Nanog iPS细胞表达了更高水平的关键胚胎干细胞标志物基因，包括内源的Nanog基因, E-ras, Esg1和Rex1。另外，Nanog筛选获得的iPS细胞能更有效地沉默用于诱导iPS表型的反转录载体，由于已知胚胎干细胞能沉默反转录病毒序列，这提示Nanog筛选细胞与胚胎干细胞更相似。Fbx15与Nanog筛选细胞的其他不同还包括Nanog筛选获得克隆的频率比Fbx15低10倍；但稳定性更高。更重要的是，与Fbx15选择的iPS细胞相比，Nanog筛选的细胞更有利于嵌合体形成，它们不但出生还能存活至成年期，甚至繁殖种系并传递到下一代。然而，这个嵌合体分析表现的显著提高却带来了4因子重编程方案的一个关键缺陷，由于c-Myc反转录病毒的再活化，大约20%的F1小鼠形成了肿瘤。

Wernig等利用Nanog以及Oct-3/4的激活作为选择标记，得到了与Okita等类似的结果：获得从表型上和功能上相当于小鼠胚胎干细胞的iPS的几率为0.1%。11作者就iPS细胞的表观遗传状态进行了进一步的分析，表明组蛋白修饰的模式更接近于胚胎干细胞，而与分化的体细胞相反。他们还证实了iPS内确实发生了反转录病毒转基因沉默（同胚胎干细胞），推测这是iPS细胞在体外或嵌合体胚胎环境中分化所必需的。这个小组还获得了嵌合体成体并可进行种系传代，但没有报道肿瘤形成。

Maherali等也利用Nanog的激活作为筛选标记，证实X染色体在重编程中的再激活，和iPS细胞株在分化中的随机X失活。12这个小组也获得了高比例的种系嵌合体。

以上三个小组的数据得出了两个关键结论。第一，4个重编程因子的表达只是瞬时需要，因为iPS细胞沉默了转基因表达后依然维持了iPS表型。显然，这是由于多能性相关基因的内源拷贝被激活。第二个关键结论是：重编程是一个有着中间阶段的渐进过程。例如，Fbx15选择的细胞似乎是部分而不是全部重编程了。

 

图2. 多能干细胞的产生。在这幅图中，分离胚胎干细胞的经典技术（右）与最近开发的产生诱导性多能干细胞的方法（左）进行了比较。胚胎干细胞来源于移植前胚胎的囊胚中的细胞群，能产生胚胎需要的所有组织的ICM(inner cell mass)。囊胚被铺在一层小鼠胚胎成纤维滋养层细胞（MEF，图中未示）上，内细胞群（ICM）产生的细胞克隆被挑选并增殖，产生了胚胎干细胞系。

而iPS细胞，则是将来源于皮肤或其他组织的体细胞在体外培养，用包含编码多能性相关的转录因子的表达载体进行转导。对于大多数细胞类型采用的是Oct-3/4、SOX2、Nanog和LIN-28这4个因子，尽管用Oct-3/4、SOX2、Nanog和LIN-28这4个因子或用全部6个因子也能成功。这些外源因子的表达引发了重编程的渐进过程，结果在一些细胞中分化表型的标志物被沉默，多能状态的标志物被诱导激活。通过基因表达、畸胎瘤行为和嵌合体分析、表观遗传状态的评估，产生的iPS细胞克隆非常类似于胚胎干细胞。尽管对iPS与胚胎干细胞的确切关系还有疑问，但两者都有望成为药物筛选和检测、干细胞治疗和再生医学的宝贵工具。

同样适用于人类细胞吗？

接下来的一个大问题是，这种4因子结合的方式是否能将人的体细胞转变成类似胚胎干细胞的iPS表型。这种无需使用人体胚胎就能形成患者特异的多能干细胞的优势不言而喻，因而引起了研究人员极大的兴趣。

希望将小鼠的研究结果应用在人体细胞上的研究人员面临了几个挑战。目前人体系统中还没有小鼠系统中的遗传工具。如果效率也是这么低，研究人员不得不在整个诱导群体的大海中寻找iPS这根针，而没有选择的辅助。人细胞中反转录病毒转导效率更低，而且人体胚胎干细胞需要不同的生长环境来维持多能性。尽管如此，人体iPS细胞还是迅速地被三个研究小组攻克并报道。13-15

Yamanaka的小组利用成年人表皮成纤维细胞作为起始群体，并通过将小鼠反转录病毒受体（Slc7a1）引入人体细胞，优化了反转录病毒的转导效率。13根据形态学来分离iPS克隆，随后证实这些克隆表达了人体胚胎干细胞的标志物，包括Oct-3/4、Nanog、Sox2、GDF3、Rex1、Fgf-4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。人体iPS细胞中也同样存在反转录病毒被沉默现象，可以通过体外分化形成具三胚层特有的标志物来证明其多能性。通过每种细胞类型的多个标志物评估，这些细胞也能分化形成多巴胺的神经元以及心肌。iPS细胞在畸胎瘤环境中表现出三系分化。与小鼠的0.1%相比，人细胞的重编程效率更低，只有0.02%。

Thomson的实验室采用了稍有不同的路线来研究人iPS细胞。14为了避免c-Myc转导中潜在的致瘤性，他们开发出另一套重编程因子：Oct-3/4、Sox2、Nanog和LIN-28。另外，他们改造了人类胚胎干细胞的选择系，用内源的Oct-3/4启动子来控制抗药性基因的表达。利用这个方法与Takahashi和Yamanaka最初的小鼠方法类似的线路和策略，他们从14种可能的重编程因子起始，最终缩小到4个候选因子。然而，他们没有采用包含选择标记的体内分化组织，而是采用由改造的胚胎干细胞体外分化而来的细胞，并利用4个重编程因子让分化的ES细胞逆转退回到未分化状态。随后他们利用胚胎及新生儿的成纤维细胞，证实了这4个因子重编程人原代细胞的能力。如Yamanaka小组产生的细胞一样，这些iPS细胞也表达典型的胚胎干细胞多能性标志物，并在畸胎瘤分析中分化成全部三个胚层的细胞。

第三个构建人类iPS细胞的小组由Daley领导，也是起始自遗传改造利用Oct-3/4作为筛选标记并分化的人胚胎干细胞。15胚胎干细胞来源的成纤维细胞通过最初的4个因子组合Oct-3/4、SOX2、KLF4和c-Myc进行反转录病毒转导，iPS细胞的分离效率相对较高，达到0.1%。为了证实原代细胞也能被重编程，他们利用了两种类型的胚胎成纤维细胞，并成功产生了iPS克隆。然而，除非再加入两种因子：hTERT和SV40大T抗原，否则从进一步发育成熟的细胞——包括新生儿成纤维细胞、成体间充质干细胞和成体成纤维细胞中都分离不到iPS克隆。Park等也研究了人iPS细胞的甲基化模式，并表明它们更类似于人类胚胎干细胞，而不是母体的成纤维细胞。15

为了解答是否某些细胞类型能比其他细胞更容易被重编程的问题，研究人员在随后集中研究小鼠不同的起始细胞群。例如，Yamanaka的小组检测了来自成体小鼠肝和胃的上皮细胞。16结果表明，原代肝细胞和胃上皮细胞这两种细胞在Fbx15的激活作为筛选标记的情况下转导Oct-3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，都可以转化为iPS细胞。这些iPS系都生成了畸胎瘤并可最终形成嵌合体成体小鼠，其中部分还可以进行种系传递。有趣的是，这些结果与他们之前的工作并不一致，9,10此前的结果表明胎鼠或鼠尾成纤维细胞，在Nanog而不是Fbx15的选择标记下，可转化为有种系传递能力的iPS细胞。与成纤维细胞来源的iPS系相比，这些源于内胚层的iPS细胞的成瘤性也有不同，胃和肝iPS细胞发生肿瘤的情况要少得多。这些差别显然是由于c-Myc在胃和肝细胞的重编程过程中的并不重要。Stadtfeld等利用产胰岛素的小鼠胰腺β细胞作为起始细胞群，证实其重编程效率与成纤维细胞相当（0.1-0.2%）。17因此，至少在小鼠中，不同器官来源的多种分化完全的细胞都能被成功地重编程。

有没有更安全的iPS细胞？

普遍的看法认为目前制造iPS细胞的方法并不适于应用在临床。忧虑不仅限于c-Myc，还包括众多的反转录病毒整合位点，它们本身有能力导致突变或致癌。因此，避免采用c-Myc、总体采用更少因子的重编程，或最终用小分子来取代这些因子，更合乎理想。为此目的，Nakagawa等进行了研究，18表明小鼠或人类成纤维细胞在没有c-Myc的情况下也能产生iPS细胞。这种3因子诱导的iPS细胞在转导与用筛选试剂进行筛选之间需要更长的间隔，表明在缺少c-Myc时重编程过程更慢。产生的细胞可形成成体嵌合体，且不会导致肿瘤。人皮肤成纤维细胞也能够在无c-Myc的条件下重编程，与有c-Myc相比效率则低很多。

为了将所需的外源因子数量减至最低，Kim等试图以内源高水平表达重编程因子的细胞群作为起始细胞群。19例如，成体小鼠神经干细胞（NSC）高水平表达内源的Sox2和c-Myc，因此可能需要更少的外源因子。实际上，成体神经干细胞只需要两种因子Oct-3/4和Klf4或者Oct-3/4和c-Myc就能产生iPS细胞。这些“2因子”的iPS细胞表达了典型的胚胎干细胞标志物，并在畸胎瘤和嵌合体中产生全部三个胚层。此外，嵌合体小鼠中没有观察到肿瘤产生。毫无疑问，研究人员很快就会在人类神经干细胞中检验这种方法。

在另一项旨在筛选能替代一种或多种重编程因子的小分子的研究中，也选择了神经干细胞作为起始细胞群。Shi等鉴定了一种G9a组蛋白甲基转移酶的抑制剂（BIX）能改善两种因子转导的神经干细胞的重编程效率。20另外，BIX的存在能让小鼠胎儿神经干细胞在有其他三种因子但缺乏Oct-3/4时产生iPS细胞。

机制

关于iPS细胞，至今仍有许多让人迷惑不解的问题，尤其是重编程发生的机制。几个实验室的结果证实重编程是一个缓慢的过程，外源重编程因子的表达只是最初所必需的，后来则可有可无。为了更好地调控重编程的诱导过程，两个小组构建了含有可诱导的四个重编程因子的表达载体。21,22目标成纤维细胞被可诱导载体感染，加入强力霉素（Dox）激活重编程因子的表达。通过瞬时控制重编程因子的表达，这些小组确定了重编程过程中事件发生的顺序。他们的研究表明，4因子至少必需表达8天后，iPS细胞才能独立维持多能状态。他们的研究还显示重编程的最初事件之一是起始的分化成纤维细胞特有的标志物如Thy1等表达下调。接着，不表达Thy-1的细胞子集开始表达多能性标志物SSEA-1。内源的Sox2、Nanog和Oct-3/4的上调是重编程过程中的晚期事件。Wernig等将这种方法再向前进一步，利用Dox诱导的iPS细胞产生嵌合体小鼠，23再从嵌合体小鼠的不同组织和器官中分离原代细胞，随后仅加入强力霉素，即可诱导发生第二次重编程。

由于可以分离中间群体，诱导策略将有助于更深入地了解和观察重编程机制。更好地了解这个机制反过来会促进开发更安全的iPS细胞制备方法。但是即使不需反转录病毒整合就能成功获得iPS细胞，在iPS实际应用于临床之前还是存在着问题和挑战。在分化的皮肤成纤维细胞中，一直保持沉默的那些积累的体细胞突变，在iPS细胞或它们定向分化的衍生细胞中也许不是这样。一些证据表明不同人类胚胎干细胞株在分化过程中按照其特定品系具有不同的偏向性，24 不同的iPS细胞系同样可能出现类似的情况。移植胚胎干细胞分化系时面临的畸胎瘤形成的风险同样也是iPS分化细胞担心的问题。

尽管如此，iPS细胞还是有很多可以立即实现的优势。例如，Park等最近制备了十种疾病特异的iPS系。25这些细胞系的分化所得到受特定疾病影响的细胞或组织类型，可用于生产药物筛选的细胞，或阐明疾病的病因。细胞的多能性是细胞生物学中长期存在的疑团，可能对再生医学的未来产生激动人心的结果，而iPS细胞正好为了解多能性的本质提供了一种手段。

参考文献
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