iPS研究陷入瓶颈阶段

　　

生物通报道  自2006年日本京都大学的山中伸弥第一次成功地将小鼠皮肤细胞转化生成诱导多能干(iPS)细胞至今，对于从事iPS研究的科研工作者而言五年时光恍若眨眼一晃而过，在这一过程中科学家们一直致力于将成体细胞编程的理念付诸到推动再生医学领域的改革中。

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由于与人类胚胎干细胞相似，人们理所当然地将iPS细胞视为可用于疾病治疗，疾病模型及药物筛选的最有潜力的资源。此外，iPS细胞还具有一些显而易见的独特优势：可从成体细胞中取材，避免了获取人类胚胎的伦理学争议；由患者自身细胞衍生的iPS细胞可用于构建与患者具有相同遗传构成的疾病模型，甚至开发出针对性的治疗策略。科学家们曾预言iPS细胞将改变生物和医学的面貌。在过去的一年里，在公开发表的论文中我们可以获知研究人员利用iPS细胞构建了大量疾病包括心脏病、精神分裂症等的细胞模型。基于iPS细胞的治疗也逐步向临床推进：在美国加州，一个研究团体期望能在未来的三年内获得批准利用iPS细胞生成的皮肤组织治疗患有大疱性表皮松懈症的患者。

然而近几个月来一些研究报道使得人们关注到iPS研究领域潜在的一些障碍：重编程效率低下，诱导突变，重编程细胞无法分化形成某些细胞类型，构建的并非总是理想的疾病模型等。在上周Nature杂志的一篇文章中证实将iPS细胞分化生成的多种组织移植至小鼠体内会产生快速的免疫排斥反应，即便iPSCs的起源细胞来自于移植小鼠本身。从而引起人们的质疑，是否有可能真正实现将iPS衍生的组织移植回供者体内。尽管目前还无人能否认iPS细胞仍具有巨大的潜力，但对于这一研究领域最初的乐观论无疑已有所降温。“现在离精确地利用这些细胞的潜能还有一段很长的路要走，所有的一切还处于起步阶段，”加州大学旧金山分校神经科学家Arnold Kriegstein说。

1.寻找新方法

从一开始，生物学家们就试图寻找比山中伸弥更安全有效生成iPS细胞的方法。山中伸弥利用了一种逆转录病毒将四种遗传重编程因子导入到细胞中。由于逆转录病毒可整合至宿主细胞的DNA中，因此有可能破坏细胞基因表达，导致癌症发生。此外其中的一个重编程因子Myc作为原癌基因本身就有致癌风险。

在旁观者看来，似乎每个月都有一些新的改良的重编程技术被公布。然而目前山中伸弥的逆转录病毒法仍被证实是最高效、应用最广泛的的方法。研究表明利用逆转录病毒技术将人类皮肤细胞转换为iPS细胞的效率约为0.01%，不整合至基因组的概率却仅为0.0001–0.0018%。而将重编程因子直接导致到人类细胞中的重编程效率仅为0.001%。低效率提高了细胞库获得iPS细胞的成本和困难，不利于开展一些稀有细胞资源的研究。此外，研究人员也试图在获得重编程后利用沉默或敲除的方法来除去Myc。然而这些操作均导致重编程效率更为低下，且沉默的Myc还有可能被重新激活。

解决这些问题已成为了这一研究领域的首要任务。研究人员还在不断改良他们的重编程方法，寻找新的作用因子，转导途径以提高重编程的效率，并降低致癌的风险。今年4月由宾夕凡尼亚大学的Edward Morrisey领导的一个研究小组报道说他们利用逆转录病毒介导microRNAs将重编程效率提高了两个数量级。“获得高效的重编程方法，并比较和分析它们在细胞稳定上和致瘤性上的差异对于我们具有重要的意义，”斯克里普斯研究所的发育神经生物学家Jeanne Loring说：“目前还没有人这样做，在我们攻克这一难题之前还有一段漫长的路途。”

2.修复缺陷

在过去的一年中又出现了一些新的问题，人们开始关注重编程过程所造成的遗传影响。在2010年7月，分别由波斯顿儿童医院George Daley和麻省总医院Konrad Hochedlinger领导的两个研究小组在发表的研究论文证实iPS细胞携带着一种“表观遗传学”记忆。研究人员发现这些iPS细胞DNA的甲基化模式和来源细胞比较相似，而并不因重编程回复到胚胎细胞状态。研究人员认为这一发现揭示了为何iPS细胞无法像胚胎干细胞一样生成多种成体细胞类型。

在不久之后，研究人员发现相比培育的人类胚胎干细胞，iPS有可能携带更多的突变。有四个研究小组在iPS细胞基因组中发现了DNA单碱基突变、DNA重排及染色体数量的差异。更为糟糕的是，研究人员证实这些iPS细胞中的一些突变并非来自起源细胞，有可能是由于重编程及培育过程所导致。Loring的研究小组报道说他们在诱导iPS细胞分化为心肌细胞过程中发现了基因重排的细胞。

这样的研究发现还在不断地涌现。在一项研究中，研究人员发现在经过一段长时间培育后iPS细胞中的大量基因重排消失了，研究人员认为这有可能是大部分严重突变的细胞在与健康细胞的竞争中被淘汰的结果。然而在今年2月，由美国萨克生物研究学院Joseph Ecke领导的研究小组称他们在人类iPS细胞系中发现了起源细胞的表观遗传学标记，在培养数代，甚至分化为特异细胞类型后这些遗传标记也没有消失。在第三项研究中，来自哈佛大学的发育生物学家Alexander Meissner在对12种iPS细胞系与20种人类胚胎干细胞进行分析后证明它们的表观遗传学及基因变异非常相似。“我们发现并非只有iPS细胞存在大量的遗传变异，而是所有的多潜能细胞都有大量的变异，”Meissner说。

Meissner的研究小组开发了一种基因表达和甲基化的“记分卡”，作为iPS细胞系多潜能状态的检测指标。这将有助于研究人员鉴别和避免实验操作导致严重的遗传畸变，筛查出受累最小的细胞系。现在研究人员正着手检测这些基因和表观遗传学效应对iPS细胞性能的影响。

今年3月21日、22日在由美国国立卫生食品与药物管理局(FDA)召开的贝尔斯达会议上研究人员表达了他们对于这些效应的关注，集中讨论了推动多能干细胞研究进入临床存在的一些障碍。研究人员提出了他们对于多能干细胞的这些突变在细胞水平上，以及对病人可能导致的不可预知及不良影响的担忧。“基因组变异将引起FDA的高度关注，”Loring说。

“现在研究者们分成了两个阵营，一方对iPS研究表示极度的悲观，而另一方则认为现在的研究发现具有积极的意义，将推动我们发现生物相关的变异，”Loring说。

3.直击局限

iPS细胞具有高度的灵活性，但它们并非万能细胞。例如，从理论上来说iPS细胞源性肝细胞应该可以修复药物毒理学筛查试验中动物的肝脏功能。然而目前研究者们仍在努力尝试将获得的人类干细胞分化形成功能性的肝脏组织。“这是因为尚不明确这些细胞发育及复杂功能所必需的一系列信号，”加州大学旧金山分校的肝病专家Holger Willenbring指出：“此外，肝细胞具有解毒，合成蛋白质等多重功能，很难找到合适的培养条件保障它们的这些功能正常发挥。“

目前对于人类干细胞最热点的研究领域之一就是利用细胞置换治疗I型糖尿病。然而目前还没有人能够生成具有完全功能，能够分泌胰岛素的成熟胰腺β细胞。这是因为研究人员还不清楚所需的一系列生长信号。且β细胞通常是在三维环境中形成，很难在培养皿中进行细胞增殖“我认为这并不重要，”加州大学旧金山分校发育生物学家Matthias Hebrok说：“利用胚胎干细胞和iPS细胞生成的β细胞‘祖细胞’就能分泌胰岛素。它们的效率虽然比正常β细胞要低，但或许足以帮助到糖尿病的患者。”

现在科学家们正在努力研究生成成熟β细胞和肝细胞的正确方法。在上周Nature杂志的一篇论文中，来自中国的研究者们利用一些在肝脏发育中起重要作用的调控因子成功地诱导小鼠皮肤细胞直接生成了肝细胞样细胞。不过Willenbring仍表示质疑这些细胞是否能够执行肝细胞的所有功能。

4.维持标准

相对简单的重编程程序推动了iPS细胞研究领域的广泛开展。然而从这一技术诞生伊始，研究者们就担忧低门槛和极其激烈的竞争意味着可能无法获得严格的标准。“迫于发表论文的压力，很多的研究人员并没有认真地确定细胞的特性，”Kriegstein说。

Kriegstein指出在去年11月由加州大学圣地亚哥分校的Alysson Muotri领导的研究小组发表的一篇论文中，作者们获得了来自单基因突变的雷特氏综合症（Rett Syndrome）患者的衍生iPS细胞，并证实这些iPS细胞能够分化为神经元。这些神经元一开始表达神经“前体细胞”的特异基因，表达的基因随即参与了神经元信号。这些来自雷特氏综合症患者的神经元比正常成人的神经元要小，并且都存在信号缺陷。然而Kriegstein认为这些分子特征还不足以表明形成了何种神经元，它们代表的是中枢神经系统的哪部分，以及如何将其与大脑中异常过程联系起来。“有可能报道的异常与预期的疾病有关，”Kriegstein说：“但是我仍然惊讶于一些研究报道大部分的神经发育及神经变性疾病都是在发育过程中的某些特异时间段影响了特异的神经细胞群。”

Muotri则称他的研究小组对于神经元的分析是非常深入的。电生理检测显示这些细胞能够启动动作电位，并发挥功能。他还指出几乎所有大脑中的神经元都表达这一基因，他并不希望将研究局限在雷特氏综合症相关的区域，因为从培养的神经元获得的结果显示这些分子机制破坏了控制行为的神经通路。“当我们在培养物中发现这一细胞表型时，我们知道我们进入了对这一复杂事物另一层面的了解，”Muotri说。

5.建模困难
目前研究人员正在努力地用患者特异性的iPS细胞构建各种已知疾病模型，然而在某些时候，研究者也不禁质疑我们能从这些疾病模型中获得什么？其中最大的争议集中在复杂的神经精神及行为学疾病上：重编程细胞能够真实地模拟精神分裂症或孤独症等疾病吗？哪一些因素以复杂的方式影响了大脑及其行为？“我曾经询问临床医生如果我们能够获得来自智力发育迟缓的患者的iPS细胞，那么你将如何在培养皿中测定神经元的IQ？”莱顿大学医学中心发育生物学家Christine Mummery说。

从事这些建模研究的科学家们仍坚持他们的工作是有意义的。在今年4月，来自萨克研究所的Fred Gage及同事报道说，他们利用来自精神分裂症的患者的皮肤细胞生成了神经元，并证实抗精神病药物洛沙平能够修复这些神经元与正常神经元的的差异。和Muotri一样，Gage认为这些模型可用于揭示精神分裂症中遗传因子影响神经元功能的机制。“虽然我们不能检测这些患者的行为，但我们可以检测这些神经元的活性。我们的目标就是要找到这些行为表型相关的细胞和分子过程，”Gage说。

在iPS细胞研究的另一个热点领域——衰老疾病研究也出现了一些问题：许多的疾病只累及成熟细胞，因此有可能与iPS细胞关联不大。Mummery说：“在帕金森氏症研究中，就存在这样的实际问题，你是否能获得足够成熟的神经元？对于研究人员而言生成目的细胞类型并不容易，而促使这些细胞成熟也是一个非常大的技术障碍。”

但也有一些研究人员认为即使是一些“年轻”细胞也显示了与衰老疾病相关性状。斯坦福大学的Renee Reijo Pera曾成功生成来自google创始人Sergey Brin的母亲Genia Brin的iPS细胞。Genia Brin是一位帕金森氏症患者。Reijo Pera证实相对于健康的人，患者来源的iPS细胞一旦分化为神经元，这些细胞就会分泌多巴胺，且对诱导细胞死亡的化合物更为敏感。“我们构建的似乎最好的帕金森氏症疾病模型，”Reijo Pera说。

许多的iPS细胞研究人员认为这一领域所显示的一些缺陷同时也是它走向成熟的一个标志。这些问题与许多生物医药领域在走入临床应用过程中所面对的问题没有什么不同。“一开始人们就处于自我陶醉中，每个人都认为iPS细胞是万能的，可以非常容易地用于治疗一切疾病，”Meissner说：“事实上并非每个人都能一夜之间成为干细胞生物学家。这只是真实地验证了事情并像我们原来想象的那么简单而已。”

（生物通：何嫱）