专访杨晓：利用条件基因敲除技术研究组织稳态维持机制

　　

    生物通报道  军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室主任杨晓研究员是国内基因敲除研究领域的领军人物。她领导的研究组在国内率先建立了小鼠条件基因打靶研究技术平台，在TGF-β/Smad和PTEN/Akt信号通路及其调控miRNA维持组织稳态的生理功能和机制方面有系列的新发现，为理解多种人类重要疾病发生的病理和分子机制提供了新的理论基础和实验模型。因其杰出的科研成果荣获“中国青年科技奖”、“中国青年女科学家奖”、“求是杰出青年实用工程奖”、日本JALAS国际奖等奖励。并于2006年入选新世纪百千万人才工程国家级人选。

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    近期杨晓研究员领导的课题组利用条件基因敲除技术构建了首例脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠，揭示了胚胎发育后期脑血管完整性维持的新机制，相关研究论文发表在了国际著名期刊《细胞》（Cell）旗下的子刊《发育细胞》（Developmental cell）杂志上。为了更详细了解这一研究成果，生物通特联系了杨晓老师以及共同通讯作者兰雨副研究员针对这一课题的研究思路以及所采用的独特的条件基因敲除技术，请教了一些读者感兴趣的问题。

（杨晓研究组，第三排右数第四位为杨晓研究员，第三排左数第四位为兰雨副研究员，图片来自杨晓研究组）

生物通：您的研究组一直处于国内基因敲除研究领域的前沿，取得了一系列的重要研究成果，您觉得其中的关键是什么呢？

杨晓研究组：我们课题组长期关注TGF-/Smad和PTEN/Akt信号通路维持组织稳态的遗传和表观遗传机制。采取的研究策略是利用基于Cre-LoxP的小鼠组织特异性条件基因敲除技术，阻断特定组织细胞对重要信号通路的反应性，从而研究该信号通路在组织器官发育和稳态维持中的生理功能及其分子机制。其中的关键，应该是小鼠组织特异性条件基因敲除技术体系的建立。基因打靶技术的发明和应用革命性地改变了现代生物医学研究的面貌。与传统的基因敲除技术相比，条件基因敲除技术可以克服重要功能基因敲除所导致的早期致死表型，模拟人类疾病相关的体细胞突变，并对突变进行时空上的调控，因此迅速成为研究基因生理功能的主流技术。我们课题组自主研制了十多种组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，其中肥大型软骨细胞、胃顶细胞以及本研究中用到的脑血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠都是在国际上首先建立的。这些组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠使得我们可以只在特定组织细胞中进行基因敲除而不累及其他组织器官，为研究这些细胞生理功能的遗传调控机制奠定了基础。

生物通：在这篇文章中，你们成功构建了首例脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠。您认为最难的是哪一步？如何克服这个难点？采用了哪些关键技术？利用这种方法是否可以敲除其他不同的基因，从而研究不同基因的功能？

杨晓研究组：心血管系统是脊椎动物机体中最早发育并行使重要生理功能的复杂系统，血管内皮细胞基因敲除常常导致胚胎致死。我们此前的研究也发现血管内皮细胞特异性Smad4基因敲除导致小鼠血管重塑异常死于胚胎发育中期（Lan Y et al: Molecular and Cellular Biology，2007）。要研究特定组织器官中内皮细胞的遗传调控机制及其在组织稳态维持中的作用，需要研制仅在特定组织器官内皮细胞表达Cre重组酶的转基因小鼠。以脑血管为例，脑血管内皮细胞间具有复杂的紧密连接，是血脑屏障的有效组成部分。与其他组织相比，脑血管内皮具有更高的周细胞覆盖率。这些特征都使得脑血管内皮较外周组织内皮具有不同的特质，使其足以胜任中枢神经系统的功能需要。但因为缺乏可用的分子标志物，一直没有任何组织器官内皮细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠成功的报道。我们其实早在2007年报道了脑血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制和鉴定。但该小鼠的成功研制基于因缘巧合的偶然。我们原想研制肺上皮细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠，却意外地发现表面活性蛋白A（SP-A）可以调控Cre重组酶在脑血管内皮细胞特异性地表达。

我们的工作证明了作用于内皮细胞的TGF-信号可以促进周细胞的黏附，调节内皮细胞和周细胞间的相互作用，阐明了一种围产期脑血管完整性维持的全新机制，对推动周细胞和神经血管领域的研究具有重要价值。研究中最难的部分还是脑血管内皮细胞功能表型的鉴定及其相关分子机制的研究。

利用这种方法可以在脑内皮细胞中敲除其他不同的基因，系统地研究脑内皮细胞生理功能的遗传调控机制，及其对血脑屏障以及脑神经系统发育和稳态维持的影响。

生物通：“条件基因敲除技术”的特别之处在哪里？

杨晓研究组：完全的基因敲除使小鼠所有细胞基因组上都存在靶基因的缺失或突变，导致体内所有细胞中靶基因活性丧失，使得在分析表型时会出现很多限制，如：1）有些重要的靶基因敲除会引起胚胎早期死亡，使得无法研究该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能。2）某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全基因敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者在分析表型时很难确定异常的表型是由一种细胞引起的或者是由几种细胞共同引起的。3）利用完全基因敲除小鼠，很难对靶基因在特定细胞特定时间内的功能进行系统的了解。4）许多疾病，包括大部分肿瘤是由体细胞突变导致的，利用完全基因敲除技术无法构建因为体细胞突变引起的人类疾病小鼠模型。

条件基因敲除技术可以在很大程度上弥补完全基因敲除技术的不足。所谓条件基因敲除技术，就是利用位点特异性重组酶系统实现时间或者空间上可调节的基因敲除。依赖于位点特异性重组酶系统的条件基因打靶技术包括两个过程：一是将位点特异性重组酶识别的DNA序列引入基因组的靶位点上；二是通过控制重组酶表达的组织特异性和时间特异性来对基因打靶进行时空上的调控。

生物通：基因敲除技术和siRNA基因沉默技术各自的优势是什么？

杨晓研究组：对于基因功能的研究来讲，尽管基因敲除技术和siRNA介导的基因沉默技术（knockdown）都是通过降低基因的表达从相应的细胞生物学表现而推断出基因的功能，二者还是有明显的区别。RNA干扰（RNAi，可以通过siRNA实现）的主要缺陷之一是可能有脱靶效应，造成研究结论的误判；避免的策略是同时做多个靶点和多次干涉实验的重复。另外基因下调程度有限，很难做到基因产物的完全缺失。但这种手段简便快捷，适合体外细胞学和高通量的研究，而不适合进行体内的功能学研究。相对而言，基因敲除技术是通过同源重组的原理在基因组水平上去除了整个基因或基因的某一段序列，彻底灭活基因。靶向性可靠，不存在脱靶问题。更重要的是，基因敲除技术在胚胎干细胞水平进行可以创建基因敲除小鼠，提供基因在体内生理状况下的功能学证据。也只有通过基因敲除技术，才能对关于特定基因生理功能的假设进行实验验证，并真正建立基因突变和疾病间的因果关系。基因敲除技术的缺点是研究周期相对比较长。目前的研究大多采用体内基因敲除技术和体外RNAi技术相结合的策略，互相取长补短。

生物通：成人脑中风发病率日趋升高，一直是现代医学急待解决的问题。TGF-/Smad4信号对于成人脑中风有什么影响？今后的研究方向是否会关注这个方向？计划采用哪些技术方法推进研究？

杨晓研究组：成人脑中风发病率日趋升高，反映了人类对于脑血管发育和相关疾病发生的分子和病理机制认识严重不足，长期缺乏理想的实验模型也是重要原因之一。目前的人类遗传学证据方面，TGF-β/Smad4信号通路的某些分子突变（包括Smad4）可以导致一种遗传性的血管异常疾病——遗传性出血性毛细血管扩张症，这类患者具有突发出血性脑卒中的风险。然而，通过大规模脑中风患者的队列来筛查TGF-β/Smad4信号通路分子表达异常的研究目前还没有报道。我们的发现揭示了TGF-β/Smad4信号通路对于脑血管完整性维持的重要性，为这样的遗传学队列筛查研究的开展提供了理论依据。今后的研究方向仍然会围绕着TGF-β/Smad4信号通路维持脑血管稳态的遗传和表观遗传机制进行进一步深入的研究。我们的发现只是揭开了冰山一角，还有很多有趣的问题亟待解决和回答，比如：在Smad4缺失导致颅内出血的小鼠模型里，其他介导周细胞粘附的分子表达和功能是否有所改变？这些分子在儿童和成人不同的脑血管相关疾病中（如新生儿脑出血、阿尔茨海默病、肌萎缩侧板硬化症）是如何被选择性调节的？这种脑内皮细胞-周细胞相互作用的缺陷是否导致血脑屏障基底膜的异常？这种异常是来源于基质金属蛋白酶活性的改变还是由于周细胞分泌的减少？血脑屏障通透性增加是细胞旁的还是跨细胞的转运增加的结果？周细胞粘附的缺陷是否影响了神经胶质细胞脚板的极性和对微血管的覆盖？在今后的研究中，我们也将通过双基因敲除的手段研究不同信号通路在脑血管稳态维持中的协同或者拮抗效应。

（生物通：何嫱）

作者简介：
杨晓
研究员，博士生导师。军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室主任。国家杰出青年基金获得者。从事分子和发育遗传学研究24年。近年来立足国内，系统研究了TGF-β/Smad和PTEN/Akt信号通路在哺乳动物组织器官发育和稳态维持中的重要生理功能和分子机制。在Developmental Cell、PNAS、EMBO J、Development等SCI杂志上发表研究论文和综述76篇（责任作者论文和综述44篇），SCI论文他引超过2500次。曾经荣获“中国青年科技奖”、“中国青年女科学家奖”、“求是杰出青年实用工程奖”、日本JALAS国际奖。2006年入选新世纪百千万人才工程国家级人选。

兰雨
军事医学科学院生物工程研究所发育和疾病遗传学研究室副研究员。
1995年本科毕业于第三军医大学临床医学系后于海军总医院血液科任住院医师，2001硕士毕业于第二军医大学内科学专业，2007年博士毕业于军事医学科学院生物工程研究所遗传学专业。博士期间及之后一直致力于研究Smads分子在小鼠血管和造血发育中的功能及相关机制。主要参与的研究成果包括：利用组织特异性条件基因打靶技术揭示了内皮细胞的Smad4信号对于小鼠发育过程中的血管重塑和血管成熟至关重要。在国际上首次建立了脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠模型，并揭示了脑血管内皮细胞的Smad4在稳定内皮细胞-周细胞相互作用以及维持脑血管完整性中的重要功能。建立并优化了胚胎发育中期血液血管干细胞的鉴定方法和检测模型。揭示了一系列Smads信号调控胚胎造血发育的功能。
2007年获中国遗传学会“青年优秀论文奖”。2008年获“全军优秀博士学位论文”。2008年以来承担国家自然科学基金项目、北京市自然科学基金项目以及973项目子课题等多项课题。近年来在Developmental Cell、Molecular and Cellular Biology、Blood、Stem cells和中国科学等国内外SCI杂志上发表研究论文和综述12篇，影响因子合计超过75。

原文摘要:
Endothelial Smad4 Maintains Cerebrovascular Integrity by Activating N-cadherin through Cooperation with Notch

Highlights
1. Smad4 loss in brain endothelial cells (ECs) causes neonatal intracranial hemorrhage
2. Endothelial Smad4 stabilizes cerebrovascular EC-pericyte interactions via N-cadherin
3. TGF-β/BMP and Notch pathways cooperatively upregulate N-cadherin in ECs

Summary
Cerebrovascular dysfunction is strongly associated with neonatal intracranial hemorrhage (ICH) and stroke in adults. Cerebrovascular endothelial cells (ECs) play important roles in maintaining a stable cerebral circulation in the central nervous system by interacting with pericytes. However, the genetic mechanisms controlling the functions of cerebral ECs are still largely unknown. Here, we report that disruption of Smad4, the central intracellular mediator of transforming growth factor-β (TGF-β) signaling, specifically in the cerebral ECs, results in perinatal ICH and blood-brain barrier breakdown. Furthermore, the mutant vessels exhibit defective mural cell coverage. Smad4 stabilizes cerebrovascular EC-pericyte interactions by regulating the transcription of N-cadherin through associating with the Notch intracellular complex at the RBP-J binding site of the N-cadherin promoter. These findings uncover a distinct role of endothelial Smad4 in maintaining cerebrovascular integrity and suggest important implications for genetic or functional deficiencies in TGF-β/Smad signaling in the pathogenesis of cerebrovascular dysfunction.