年度创新：无需超声，从大肠杆菌中抽提活性蛋白

参加2011生命科学十大创新产品评选，了解生命科学发展的新动向！大肠杆菌表达蛋白的种种优点不必赘述。然而让许多研究者深感头疼的是在破菌过程中，机械法不可避免的产热、剪切力和气泡等对娇弱宝贵的蛋白造成巨大损失！有什么方法能温和、高效率地抽提活性蛋白、保持其天然结构？这个伟大的工具已经上市啦！她就是BugBuster Master Mix！

　　

大肠杆菌表达蛋白的种种优点不必赘述。然而让许多研究者深感头疼的是在破菌过程中，机械法不可避免的产热、剪切力和气泡等对娇弱宝贵的蛋白造成巨大损失！有什么方法能温和、高效率地抽提活性蛋白、保持其天然结构，而且比酶法重复性好，易于放大和平行操作？这个伟大的工具已经上市啦！她就是默克密理博Novagen的BugBuster Master Mix！有人甚至亲切地称之为BugBuster MM。

BugBuster®蛋白抽提试剂

BugBuster®蛋白抽提试剂可温和破碎大肠杆菌细胞壁，并释放可溶性蛋白，可以替代机械方法，如弗氏压碎或超声处理等激烈处理，具有简单、快速、低成本的特点，抽提的蛋白可直接用于纯化或其它后续实验。该专利配方采用去污剂混合物，能够使细胞壁穿孔，同时保持蛋白活性。

实际操作时将离心收集的细胞悬于BugBuster中，此时加入Benzonase®核酸酶可降低抽提物中由于染色体释放而导致的高粘度，加入高度特异性的rLysozyme溶液，可以通过水解细胞壁中N-乙酰胞壁酰胺键，导致细胞壁破裂，从而提高蛋白抽提效率，尤其对于大的蛋白质的抽提。简单孵育后，离心去除不可溶的细胞碎片。澄清的抽提物可以直接使用Novagen的亲和介质（包括GST•Bind、GST•Mag、His•Bind、His•Mag和S•Tag树脂）或其他层析基质纯化。结合到亲和树脂上后，过量的BugBuster可通过用相应缓冲液洗柱子轻易去除。在表达蛋白不可溶时，BugBuster也可用于制备高纯度包涵体。

标准的BugBuster是1× 的Tris缓冲液体，室温稳定。500ml试剂与10000U Benzonase®核酸酶同时提供，以制备低粘度抽提物并从蛋白制备物中去除核酸。BugBuster和Benzonase与普通蛋白酶抑制剂兼容。

BugBuster Master Mix

BugBuster Master Mix是按最佳配比预混了BugBuster蛋白抽提试剂、Benzonase®核酸酶以及rLysozyme溶液。这种方便型试剂可以从革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中最大程度地抽提活性可溶蛋白。预混试剂不仅省去了多次计算、添加试剂的麻烦，还可非常方便地根据起始样品等比例缩放试剂用量。默克密理博还提供中英文操作说明书，相当贴心。两种包装分别满足从20g和200g细胞糊中抽提蛋白。

 
E.coli裂解细胞方法的比较

从500ml经诱导的、带有编码GST的pET-41a(+)的BL21(DE3)培养体系中取出50ml样品，离心收集细胞并分别重悬于2ml 1×PBS缓冲液，另一市售蛋白抽提试剂以及BugBuster®试剂。用PBS重悬的样品用超声波10pulses（脉冲）50％duty共处理30s。用裂解试剂遵从相应操作说明书操作。抽提效果是经过离心后用Novagen的GST•Tag分析试剂盒检测GST酶活来评价的。

Tips：

为什么BugBuster Master Mix是做原核表达蛋白抽提的最佳选择？

活性大蛋白：大蛋白、有活性的蛋白（如GST•Tag融合蛋白）在抽提时要相当小心。为了获得更高的得率并确实保持蛋白的活性，建议避免超声等机械破菌操作带来的热效应、剪切作用及产生气泡等对蛋白的破坏作用。BugBuster MM极其温和高效，且专一地去除核酸，降低样品的粘度，使每次蛋白抽提、纯化都能获得稳定的产量和活性。

高通量、多样本的平行实验：在做“蛋白诱导表达条件-产量”等平行评估实验，或突变体平行表达评估等实验时，杜绝超声不足或过度造成的蛋白得率系统误差至关重要。只需按细胞沉淀量平行加入BugBuster MM，即可获得最佳重现性和平行性的数据，操作非常高效。

扩大发酵：缩放发酵规模需要重新摸索烈菌条件，而BugBuster方法只需通过简单的线性计算，根据实际发酵体积相应增加裂解试剂用量即可，在表达体积很小时甚至更具优势。

请为BugBuster Master Mix 投上一票！