单分子测序助力脆性X综合征的研究[创新技巧]

研究人员利用Pacific Biosciences公司的单分子实时（SMRT）测序技术，从大量扩增的CGG重复序列中产生高质量的测序数据。结果表明，环状共有序列的读取产生了生理相关范围的重复扩增。而对长的重复等位基因的测序能力似乎仅受读长限制。原始读长超过10 kb，使得环状共有序列覆盖了超过750个CGG重复片段。通过这种方法，如今能够以单碱基分辨率完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于疾病的准确诊断。

生物通报道 美国加州大学戴维斯分校（UC Davis）医学院及Pacific Biosciences公司的研究人员利用单分子实时测序技术，对脆性X综合征的关键基因FMR1中的CGG片段扩增进行了测序。他们在第15届脆性X和早发性认知缺损国际研讨会上公布了他们的研究成果。

脆性X综合征（又称Martin-Bell综合征）是一种遗传性综合征。它导致一系列特征性症状，包括生理、智力、情绪、以及行为上的异常。症状的轻重各有不同。该疾病伴随着X染色体上一段三核苷酸序列（CGG）的扩增。这种扩增导致了一种称为FMR1的蛋白质无法在病人体内表达，而该蛋白质是神经正常发育所必需的。

脆性X智力低下（FMR1）基因位于X染色体上，其5’非翻译区（5’UTR）包含了CGG三核苷酸的重复序列。大部分人的CGG片段重复5-44次。CGG片段的扩增与认知力和生殖功能受损相关。如果一个人含有45-54个重复序列，则被认为是“灰色地带”，而55-200个重复序列被称为前突变，200个以上重复序列则被称为全突变。

中度CGG重复序列扩增（55-200个CGG重复）可导致脆性X相关性震颤/共济失调综合征（FXTAS），一种以意向性震颤、步态共济失调和其他症状为特征的迟发性神经变性疾病1。而高度CGG重复序列扩增（>200个CGG重复）可引起转录沉默和FMR1编码蛋白（FMRP）的功能丧失，从而导致脆性X染色体综合征1。

由于目前的测序方法都依赖于大量相同拷贝的读取，因而大量扩增的CGG重复（>100）只能生成不连贯的信号（图1）。这阻碍了研究人员获得单碱基分辨率的测序数据。

图1：随着重复扩增数量的增多，生成大量相同的拷贝变得越来越困难。这阻碍了对大部分疾病范围(>100次重复)内重复扩增序列的准确测序。

于是，研究人员利用Pacific Biosciences公司的单分子实时（SMRT）测序技术，试图从大量扩增的CGG重复序列中产生高质量的测序数据（图2）。他们首先利用PCR从人类基因组DNA中扩增出带不同CGG重复的FMR1序列，制备出待测文库。随后加上发夹测序接头，生成闭合的环状测序模板。之后利用Pacific Biosciences RS对样品进行测序。最后采用BLASR算法将长读取装配成环状共有序列（CCS），而目标序列的覆盖度至少为3倍。

 
结果表明，环状共有序列的读取产生了生理相关范围的重复扩增。而对长的重复等位基因的测序能力似乎仅受读长限制。原始读长超过10 kb，使得环状共有序列覆盖了超过750个CGG重复片段。

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图3：一段CGG重复片段范围内的环状共有序列读取图。接近155个重复的峰是SMRT cell被动上样偏向（passive loading bias）与较小插入片段优势的综合结果。示例：环状共有序列读取包含372个CGG重复。

研究人员认为，通过这种方法，如今能够以单碱基分辨率完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于疾病的准确诊断。（生物通 余亮）

参考文献
1. Oostra, B.A. and R. Willemsen, FMR1: a gene with three faces. Biochim Biophys Acta, 2009. 1790(6): p. 467-77.
2. Eid, J., et al., Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.