胰腺癌基因治疗新进展

胰腺癌高度恶性,是威胁人类健康与死亡的主要敌人。当今,我们已进入“分子时代”,人们寄希望于依据胰腺癌的分子和基因异常发展的新治疗方法——基因治疗,能够带给胰腺癌病人光明的明天。

　　

胰腺癌高度恶性,是威胁人类健康与死亡的主要敌人。在美国已成为第二大消化道肿瘤的死因,在西方国家中列第四位;在上海发病率20年内增加了4倍。尽管胰腺癌诊断和围手术期处理有了提高,可是预后并没有显著改善。国际胰腺癌协会(IARC)2000年的一项报告表明:2000年新发胰腺癌病例217000人,其中当年死亡213000人。总体5年生存率仅为0.4%。当今,我们已进入“分子时代”,人们寄希望于依据胰腺癌的分子和基因异常发展的新治疗方法——基因治疗,能够带给胰腺癌病人光明的明天。

1　基因治疗的载体、途径

在对胰腺癌进行基因治疗的过程中,由载体将目的基因高效、特异、安全的转染至靶细胞是基因治疗的关键,目前多采用病毒[5]及脂质体方法。不完全复制及选择性复制腺病毒载体现已应用于胰腺癌的基因治疗。基因治疗的途径也由最初的瘤内注射、局部给药发展到近来经静脉注射[9]、动脉注射和经腹膜注射。现在,已经证明腺病毒载体PRI/ING201和Ci-1042(Onyx-015)用于胰腺癌进行基因治疗有效。PRI/INGN201是带有巨细胞病毒启动子(Ad5CMV-p53)的第一代不完全复制腺病毒载体,已用于携带人抑癌基因p53治疗胰腺癌,到目前为止已应用于450项基因传递的试验,最初每天给予数量超过2.5×1012病毒颗粒,多经瘤体内注射。但到目前为止,尚无病毒进行水平传递的证据。选择性复制腺病毒载体Ci-1042经动脉给药目前正用于结肠癌肝转移I期、II期临床观察。
　
解决基因转染低效的方法,目前已开始采用胰腺癌组织特异性启动子,如midkine(MKp)及环氧和酶2(Cox2p)启动子[13]。Ohashietal[14]利用带有胰腺癌细胞内部启动子CEA腺病毒载体,提高靶基因胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)基因的精确调控,腺病毒介导HSV-TK基因和CEA启动子转导可特异性的提高产CEA胰腺癌细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性,对胰腺癌特别是高产CEA的胰腺癌细胞有特殊的治疗意义。

2　基因前药激活治疗

基因导向的酶解药物前体治疗(GDEPT),是利用正常与恶性细胞转录水平表达非哺乳类“自杀基因”的差异进行基因转染,通过特异性选择到达肿瘤所在位置,将无毒的前药转化为高化学毒性药物,此方法的优点在于高度的特异性治疗,同系统给药相比有着极低的毒副作用。到目前已有水痘-带状疱疹病毒腺嘧啶核苷激酶(VZV-TK)与6-甲氧嘌呤阿糖核苷系统、大肠杆菌gtp基因与6-硫黄嘌呤系统、大肠杆菌Deo基因与6-甲基嘌呤脱氧核苷系统、融合自杀基因、其它自杀基因前药激活治疗。

融合自杀基因治疗是利用基因工程技术将自杀基因和另一种基因连接在一起,以增强自杀基因治疗肿瘤的效果。胞嘧啶脱氨酶-胸腺嘧啶核苷激酶(CD-TK)融合基因应用较多。目前,有一种新颖的酶激活前药治疗正在开展,该治疗使用克隆自绿脓假单胞菌的蛋氨酸酶基因(MET),联合二硫化硒蛋氨酸(SeMET)作为前药,并作用带有CMV-5启动子(rAd-MET)编码蛋氨酸酶基因的腺病毒作为载体。MET基因转染联合二硫化硒蛋氨酸将生理性化合物二硫化硒蛋氨酸转化为高度毒性的甲基二硫化硒而起肿瘤杀伤作用。转染rAd-MET的胰腺癌细胞对二硫化硒蛋氨酸的IC50较未转染rAd-MET、转染腺病毒载体的癌细胞低1000多倍。包括腺癌细胞在内的所有被检测癌细胞都能被rAd-MET联合SeMET所抑制。在仅含有3%rAd-MET转染的癌细胞培养基中加入二硫化硒蛋氨酸可导致80%未转染细胞死亡。这一强大的旁观者效应就是来自于转染MET基因的癌细胞释放高毒性甲基二硫化硒的结果。在rAd-MET/SeMET治疗的胰腺癌细胞中,由于线粒体膜通透性改变激活caspase产生过氧化,出现细胞凋亡。MET/SeMET系统的效果已在大鼠腹水模型中进行检验,治疗组体内瘤体生长显著减慢,72d后生存率为60%而对照组仅为0%[15]。

但是,当前的GDEPT基因转导系统的完成仅仅限于动物体内转染。诱导自杀基因治疗高效、特异、安全、无毒,具有良好的应用前景,在最佳基因选择、转导载体发展和应用方式等方面尚待进一步研究和完善。

3　替换抑癌基因

替换抑癌基因,进行p53、p16、DPC-4基因传递的转基因治疗是目前胰腺癌基因治疗的主要方法之一。p16基因是一种肿瘤抑制基因,其所编码的p16蛋白能高度特异性地结合并抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)的活性,参与对细胞周期的调控,对细胞增殖起负性调节作用。胰腺癌p16基因失活的机制包括纯合缺失及5’CPG岛甲基化。p16基因变异在胰腺癌的发生、发展过程中具有非常重要的作用,p16蛋白失表达与胰腺癌的临床分期及生存期密切相关。p16基因及蛋白表达状态可作为评估胰腺癌恶性程度及侵袭能力的指标。体外研究表明,表达p16基因的腺病毒可抑制p16基因缺失的胰腺癌细胞株的生长。故p16靶基因治疗可能成为治疗胰腺癌的方法之一。采用腺病毒介导将野生型p53基因转染p53突变型胰腺癌细胞系,可使p53阳性克隆的肿瘤细胞生长明显降低,DNA合成下降,细胞凋亡比例增高。逆转录病毒p53载体对裸鼠原发性胰腺癌及其腹腔转移也具有明显抑制作用。

抑癌基因替代治疗的缺点是由于肿瘤的发生是多基因协同作用、多因素参与和多阶段综合发展的结果,单纯导入某一抑癌基因或反义基因在实验中可能会取得一定疗效,但最终难以取得令人满意的效果。最近,Muscarella等报道联合p16和p53基因转移可以有效诱导肿瘤细胞凋亡,这些研究为胰腺癌基因治疗提供了新的应用策略。

4　反义基因治疗

人工合成与肿瘤细胞癌基因在转录和翻译水平上相结合的核苷酸阻断癌基因的表达,以及阻断癌细胞内异常信号传导,使之进入正常分化轨道或引起细胞凋亡的反义基因治疗,可使癌细胞生长受到显著抑制。

针对K-ras、ATK2、erbB2癌基因的突变作为反义基因治疗靶点,以癌基因的mRNA全长作为反义链与细胞内的癌基因序列结合,从而阻断基因翻译过程的反义基因治疗目前应用较多。反义寡核苷酸链的传递有多种方式,例如有一种寡核苷酸链和细胞穿透肽相联连,构建含K-ras反义基因片段的质粒并经脂质体转导入胰腺癌细胞系AsPC-1,并用于治疗大鼠种植瘤,在此动物模型中显示出显著的肿瘤生长抑制作用,而且无任何毒性作用。ISIS-2503是一种20碱基反义寡核苷酸链,能够与人rasmRNA翻译起始区碱基杂交使RNA降解而减少其表达。现在正用于30例晚期胰腺癌 期临床观察,其中16例病情已稳定,2例出现轻微的并发症。

突变型的P53也已成为反义抑制的靶基因,主要使用外源寡核苷酸链及内源性表达反义结构,但临床观察结果非常令人失望。

5　免疫基因治疗

免疫基因治疗是将各类细胞因子基因转导入肿瘤或其他免疫效应细胞,使其在机体表达分泌细胞因子,或利用其他基因增强肿瘤细胞的免疫原性和/或免疫系统的功能,加速肿瘤消退的方法。胰腺癌肿瘤内注射重组人肿瘤坏死因子(TNF)可抑制肿瘤生长,Satoetal[25]在胰腺癌细胞系AsPC-1、PANc-1中转染TNF受体R55基因,表现出显著高于其母代细胞系的TNF敏感性,联合应用突变型TNF471具有更强的抗肿瘤作用。

应用IL-2基因修饰的胰腺癌细胞瘤苗,可产生特异性主动免疫反应,联合IL-2基因和γ-干扰素基因能诱导更强的抗肿瘤免疫反应,应用含有IL-12基因的重组痘苗病毒转染胰腺癌细胞,荷瘤鼠成瘤时间延长、肿瘤体积较小,肿瘤生长受到抑制。
免疫基因治疗无需多次反复全身应用细胞因子,副作用小,并可通过多种途径调动机体的免疫反应。但尚不能确定何种细胞因子基因转染对胰腺癌的疗效最佳。细胞因子具有双重性能,转染相同的细胞因子有时会得到不同的甚至截然相反的结果。

6　受体基因治疗

研究表明,生长抑素及类似物不仅能抑制胰腺癌细胞的增殖,且能促进胰腺癌细胞的凋亡。生长抑素是由D细胞分泌的一种环状多肽类激素,广泛存在于人体的内分泌及外分泌系统中,并在调节人体多种激素的分泌过程中发挥重要作用。目前人们发现人生长抑制受体(SSR)属于G蛋白偶连性受体,已克隆得到5种受体亚型,即SSR1-SSR5。有研究认为胰腺癌组织中所表达的SSR以SSR2为主,这样就可经选择对SSR2高亲和力的生长抑素类似物如奥曲肽、TC-160等来治疗胰腺癌。本课题组近来在实验中发现:人胰腺癌细胞不表达生长抑制受体亚型 (SSR2),体外实验中生长抑素类似物奥曲肽对人胰腺癌细胞无抑制作用。

在胰腺癌细胞系AsPC-1、PANc-1中转染TNF受体R55基因,表现出显著高于其母代细胞系的TNF敏感性,联合应用突变型TNF471具有更强的抗肿瘤作用。

7　展望

胰腺癌基因治疗目前多停留在细胞和动物水平,从基础实验研究过渡到临床实际应用仍有相当长一段距离。可喜的是,有些基因治疗已在进行体内实验,有些已开始进行临床试验,并已取得令人鼓舞的治疗效果。随着分子生物学技术的进步及胰腺癌病因学研究的深入,必然为胰腺癌基因治疗提供新的有效方法,为攻克胰腺癌治疗的难关带来希望。