Nat Methods新技术聚焦2011最值得关注的技术之一

　　

生物通报道：《Nature Methods》2010年选出了年度技术：光遗传学（optogenetic）工具，除此之外也整理出了来年最值得关注的几项技术，其中就包含了锌指核酸酶技术。

近期来自美国麻省总医院，哈佛医学院，耶鲁大学等处的研究人员获得了构建锌指核酸酶的一种新方法，这种方法操作简单，较之前的方法成功率高，这一研究成果公布在Nature Methods杂志上。

领导这一研究的是在锌指技术方面获得多项成果的Keith Joung博士，他曾在08年提出了一个制备有效的锌指核酸酶的方法，称之为“开放性代码”（OPEN），并创建了一个数据库，里面有独特的锌指结构组成的66个单独的库或者66套集合库，从而打破了之前被一生物公司垄断的局面。

锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制酶，由锌指结构的DNA结合结构域和DNA切割结构域融合而成。它们能够识别并结合指定的位点，高效且精确地切断靶DNA。随后细胞利用天然的DNA修复过程——“同源定向修复”或“非同源末端连接”来治愈靶的断裂。这样，研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑，包括基因修复、基因删除和定向的基因添加。

近年来，作为一种可能在临床中得到广泛应用的朝阳技术，锌指核酸酶得到了多方关注，并已经在几种不同系统内成功靶定了基因组，为生物学研究提供了新型工具。

一般的锌指核酸酶方法需要筛选组合库，而最新的这种称为相邻装配（CoDA，context-dependent assembly）的新方法结合相邻指元件的作用，提供了成功率，而且操作简单。比如将2个拥有相同中指（F2元件）的三锌指芯片，通过组合第1个芯片的首指（F1元件），共同的中指（F2元件）和第2个芯片的尾指（F3元件），形成一个新的特异的三锌指芯片。

这种方法的主要优点是多指芯片正常工作的概率将会更高，因为CoDA并不把指元件看作独立元件，而是其结合了相邻指元件的效果。另外括构建多指芯片的速度和既没有专门技能也没有劳动强度选择的需要。缺点主要是CoDA方法不能被用来标记可被模块化组装普遍标记的位点，而且CoDA限制了共同中间元件的特性，没有平衡所有锌指对最终芯片亲和力和特异性的效果。最后就是CoDA忽略了相邻上下游碱基的特性，所以其不能在人体多能干细胞中引入改变，这对治疗应用非常重要。

研究人员利用这一方法快速改变了斑马鱼，大豆和拟南芥中的基因，包括斑马鱼的24个基因靶点，以及拟南芥的13个基因靶点，大豆中1个双拷贝基因靶点。通过CoDA构建的ZFNs获得的突变成功率可与通过OPEN构建的ZFNs所获得的突变成功率相当。

（生物通：万纹）

原文摘要：

Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly (CoDA)

Engineered zinc-finger nucleases (ZFNs) enable targeted genome modification. Here we describe context-dependent assembly (CoDA), a platform for engineering ZFNs using only standard cloning techniques or custom DNA synthesis. Using CoDA-generated ZFNs, we rapidly altered 20 genes in Danio rerio, Arabidopsis thaliana and Glycine max. The simplicity and efficacy of CoDA will enable broad adoption of ZFN technology and make possible large-scale projects focused on multigene pathways or genome-wide alterations.