创新参选：胰酶消化方法的改进

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“赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。

目前生物通已经公布了一些项目，这些项目也倍受读者的关注。为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通将于2010年9月10日从在此之前投稿的参选者中抽出三名，送出世博会门票一张。

实践出真知，华中农业大学的金丹总结了多个细胞的消化经验，对胰酶消化方法进行了改进。

背景：对于绝大多数实验室培养的用作模型的细胞来说，细胞传代是一项必不可少的工作，常用的传代方法为：向长满了细胞的培养瓶中加入足量胰酶浸泡消化细胞一段时间后再分散细胞并传代。但是各种细胞对胰酶的敏感度千差万别，有的细胞比如HEK293系列的极容易消化，而有些如RAW264.7几乎不能被胰酶从瓶壁上消化下来。消化时间不够，后续的细胞分散就需要用机械力，这样对细胞损伤太大，而且往往达不到很好的效果；消化过度，则会引起某些敏感的细胞的死亡，对于广大新手来说，在培养细胞时胰酶的消化程度很难把握。

方法改进：1 . 有些实验室采用添加EDTA的方法增加胰酶的消化能力，但是添加的EDTA会大量螯合体系中的二价离子，如Ca2+，如此会导致细胞尤为环境及胞内离子的大量流失，容易对细胞照成更大的损伤。因此，本人改进的方法中不使用添加EDTA的胰酶消化液。

2. 胰酶消化：细胞长满后，弃培养基，用无菌PBS或者0.25%的胰酶溶液适量浸洗细胞一次，浸洗的目的是去除生活藏培养基中的血清等抑制胰酶活性的物质，洗完后弃净洗液，再次用0.25%的胰酶溶液润洗一次，洗完后小心丢弃洗液，此时瓶内还会残留很少的胰酶溶液，盖好细胞瓶塞，放入培养箱进行消化直到对光可见明显的细胞间隙增大，瓶内变圆细胞开始整体脱落，此时加入生长培养基终止消化，后续轻微用移液器吹打即可很好的分散细胞。

3. 对于本身贴壁不牢但是又容易聚集生长的细胞，典型的例子就是HEK293,方法可以改进为：采用上述残液消化，但是在放入37度培养箱消化时培养瓶倒置，适当延长消化时间（HEK293:5-8min）；因为无论是直接倒出还是用吸管吸，培养瓶内残留的胰酶还是很多，这类细胞极易从瓶壁上大块脱落后，在胰酶溶液里面形成团状，极难被消化分散。

4. 对RAW264.7这类极难用胰酶消化的细胞，可采用的改进方法如下：第二次用胰酶浸洗时延长时间至5-10min，之后倒出胰酶，剩余残液继续放回培养箱中进行消化10-15min，此时细胞可很容易的被吹打分散均匀。

结果：本实验室培养了COS7,HEK293,NIH3T3,HepG2,RAW264.7以及原代细胞等多种生长特性的细胞，从贴壁不牢固的COS7,HEK293等细胞到一般用细胞刮刀传代的RAW264.7,现在基本都采用这种传代方法，在传代培养是可以获得很好的单细胞悬液，对细胞的损害也比以前的方法（浸泡消化，添加EDTA）小很多，细胞生长状态良好，最大的优点是很容易掌握，尤其是对新手！

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