创新参选：PCR产物直接测序方法的改进

“赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通将于2010年7月10日从在此之前投稿的参选者中抽出三名，送出世博会门票或等值的礼品。

　　

“赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。

目前生物通已经公布了一些项目，这些项目也倍受读者的关注。为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通将于2010年7月10日从在此之前投稿的参选者中抽出三名，送出世博会门票或等值的礼品。

武汉生物制品研究所的孟胜利博士对PCR产物直接测序的方法进行了改进。

参选项目：PCR产物直接测序方法的改进

背景：在PCR试验中，特别是需要对PCR产物进行测序时，利用PCR引物直接测序，往往发现测序图谱不清楚，出现双峰，导致测序结果无法使用或者可以使用的可靠测序部分很少(见下图)；但将PCR产物克隆进入pUC18/19 T载体进行克隆，然后利用T载体上的通用引物进行测序，我们发现测序图谱清楚，没有双峰，所读序列很长，测序成功率高。

但我们发现PCR产物克隆入T载体后，利用T载体上引物测序的前期试验中会有几个缺点：1.PCR反应中只能使用普通PCR酶而不能使用高保真PCR酶；2.若使用高保真PCR酶，同时就需要使用加A试剂盒；3.个别既能高保证又能在PCR末端加A的PCR酶价格太昂贵；4.克隆过程本身会引入突变；5.克隆出现假阳性6.由于增加克隆步骤，因此增加了试验时间；

我们发现两种测序方法的本质相同，都是利用特异性引物进行测序，测序结果的好坏只与所使用的测序引物序列相关，因此我们尝试将PCR产物直接测序的非突变、快速直接与克隆测序图谱清楚、成功率高相结合。

方法改进：我们在特异性引物的5’端加上T载体上通用引物序列（M13R/M13F）进行PCR，然后利用通用引物（M13R/M13F）进行PCR测序（见下图）。

在此我们以扩增狂犬病毒G基因为例说明，以前是直接用特引物测序：

改进前直接用M220/G780和MSL/l1测序，改进后利用通用引物M13R/M13F测序（红色为通用引物）

Primer	改进前引物	改进后引物	Nucleotide position
M13RM220	GGTGTATCAACATGAATTC	TGTAAAACGACGGCCAGT GGTGTATCAACATGAATTC	3000-3019
M13FG780	CATGTTCCGTCCATAAG	CAGGAAACAGCTATGACC CATGTTCCGTCCATAAG	4077-4096
M13FMSL	TGGATTTGTGGATGA AAGAGGC	CAGGAAACAGCTATGACC TGGATTTGTGGATGA AAGAGGC	3995-4016
M13RL1	CCGGCTCCTGTTTGATTCAGAG	TGTAAAACGACGGCCAGT CCGGCTCCTGTTTGATTCAGAG	5730-5753

a The positions of primers are based on the PV strain of rabies virus

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