创新参选：快速的定向TA克隆

　　

2010实验室创新技术大奖评选活动开展一个多月以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目。不看不知道，原来大家在实验中还有这么多小技巧，小创意。从今天开始，生物通将刊登参选项目，与读者分享。如果您的实验也有类似的改进或者从其它媒体处学习到一些改进，别犹豫，赶快参选。无论是小改进，还是大创意，我们都欢迎。

据南京农业大学的刘同学介绍，TA克隆可作如下改进。

项目：快速的定向TA克隆

背景：TA克隆是目前最常用的克隆方法之一。Taq DNA 聚合酶会在PCR产物的末端加上一个A残基，这样就能很简单快速地与T载体连接。不过，插入的片段可能是正向的，也可能是反向的，如果下一步是做基因表达，那么还需要测序来确定片段的方向是否正确。

方法改进：我们发现有一种快速的方法，只需在一个PCR引物上添加6个额外的碱基，并对载体做一点小小的改动，就能方便地进行TA克隆，并利用限制性酶切判断片段的方向。

我们使用的是pT7-GFP载体，并利用Eam1 105I消化来产生T垂悬。当然，其它载体也可以用。之后扩增PCR产物。PCR产物在克隆时应注意：反向引物的5’端应加上AATTAA这六个碱基。随后用试剂盒纯化PCR产物，再用T4连接酶进行连接。如果PCR产物反向插入到片段中，则重组质粒上形成了PacI的识别位点(5′-TTAATTAA-3′)，而正向插入则不会。连接后纯化反应，再接着进行PacI消化。反向插入的重组质粒被PacI线性化，因而在平板上难以生长。

结果：这是一种高效的克隆方法，能快速鉴定出正向插入的重组质粒。

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