Nature Methods：新型蛋白结构分析技术[创新技巧]

生物通报道：来自美国劳伦斯伯克力国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory，简称LBNL），乔治亚大学，斯克里普斯研究所等处的研究人员开发了一种新型的蛋白结构分析技术，利用这种技术，研究人员能更精确分析蛋白结构，并且将分析速度提高上百倍。这一研究成果公布在Nature Methods杂志上。

文章的通讯作者是来自LBNL的John Tainer教授，和乔治亚大学的Michael Adams教授，前者是著名的结构研究分析专家，在结构分析研究方面有自己独特的见解。

比如在进行连接酶修复DNA双螺旋的过程研究中，其研究组利用X-rays和SIBYLS synchrotron beamline，对DNA连接酶、PCNA以及二者相互结合后的复杂动力学结构进行成像分析，并且还将X-rays结晶与小角度X-rays散射（small angle X-ray scattering ，SAXS）结合起来，利用一种叫做Sulfolobus solfataricus的有机体进行实验，获得了杰出的研究成果。

21世纪初，各种重要物种的基因组(全DNA序列，包括有功能的基因编码序列和功能未知的“ 垃圾”序列）的测定工作已基本完成，系统地解读DNA编码，由此理解细胞功能的分子机制和调控机制，不仅有了基本的条件，而且正在成为越来越重要的工作。由于细胞的大部分功能是由蛋白质来行使的，而蛋白质的氨基酸序列是由基因编码的，因此，解读DNA编码的任务之一是研究蛋白质序列、结构和功能三者之间的关系。

蛋白质结构是三维的空间结构，在去折叠态时，蛋白质链上相距较远的氨基酸残基之间的物理相互作用较少，在折叠态时，则存在很多这样的长程特异相互作用，它们实际上定义了蛋白质的三级结构。所谓蛋白质结构主要是针对这种长程的特异相互作用而言。它们本质上是三维空间中原子和原子基团的相对位置和取向，测定蛋白质的空间结构就是要通过物（化学）手段确定这些相对位置和取向。

在现代生物学研究中，蛋白空间结构的实验测定方法最常用的包括X射线晶体学、二维核磁共振(2D-NMR)，其中X射线晶体学的特点是可以确定原子精度的结构，对于有机分子和蛋白质，可以给出几百到上万个原子的相对坐标。而二维核磁共振(2D-NMR)的二维频域谱中的交叉峰反映某个核与相邻的另一核之间的相互作用。

这两种技术虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间，随着结构基因组学的发展，新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要，可以说结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。

在这篇文章中，研究人员已开发出一种能快速高效测定蛋白结构的方法，这一方法能在几天之内完成以往几年才能完成的实验。这种小角度X-射线散射技术能更精确分析蛋白结构。

这种小角度X-射线散射（small angle x-ray scattering，SAXS）方法对处于自然状态下（如在溶液之中）的蛋白进行成像，其分辨率大约为10埃米（1埃米等于1/10纳米），足够用来测定蛋白的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。

具体而言就是在强光源SIBYLS光束作用下，研究人员利用SAXS技术，可以得到自然状态下蛋白质的图像。SAXS技术的空间分辨率在10埃左右，这足以检测到任何一种蛋白质的三维结构。强光源可以使每个实验所需的材料缩减到最小，因此该实验技术对几乎任何生物分子都有实用意义。并且研究人员为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究，具体过程见下图：

（SAXS技术对处于自然状态下（如在溶液之中）的蛋白进行成像，其分辨率大约为10埃米（1埃米等于1/10纳米），足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。 ）

除此之外，研究人员还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心（NERSC）的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了高温微生物Pyrococcus furiosus（火球菌）的40组蛋白结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15％的信息量来说，这是一项巨大的进步。

高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。

当然，每一种实验方法都有它的优点与缺陷，比如每个实验方法的时间和空间分辨率不同，而这种方法追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。因此如果要想获得蛋白质结构的完整图像，最好还是集中几种实验方法的结果，使它们相互衔接。它们之间的缺失部分只能通过计算模拟和理论模型来构建和预测。

因此发展有关蛋白的一般性理论也是非常重要的，我们可以通过理论与实验的结合，不仅可以某个蛋白的一般的物理化学性质，还可以理解它的特殊的生物功能。

在国际上，美国首先提出大规模测定蛋白质结构的计划，现在已经进入第二期的产出阶段。其他发达国家（欧盟和日本）也相继启动自己的结构基因组计划。

根据美国第一期的试验计划，发现X射线晶体学仍然是测定结构的主要手段，这与预期的结果相符。过去和现在情况都是这样，蛋白结构数据库中的80％的结构来自X射线衍射。其他有重要贡献的手段有核磁共振和低温冷冻电镜，由于这三种方法的重要性，最近几年，它们都有很大的改进，不过也有越来越多的新技术在这一领域占据了新位置，比如单分子技术，SAXS等，相信在未来，还会有类似这一最新成果的新技术不断涌现，终有一天，我们会破解蛋白这一生命功能重要执行者的所有秘密。

(生物通：万纹)

原文摘要：

Robust, high-throughput solution structural analyses by small angle X-ray scattering (SAXS)

We present an efficient pipeline enabling high-throughput analysis of protein structure in solution with small angle X-ray scattering (SAXS). Our SAXS pipeline combines automated sample handling of microliter volumes, temperature and anaerobic control, rapid data collection and data analysis, and couples structural analysis with automated archiving. We subjected 50 representative proteins, mostly from Pyrococcus furiosus, to this pipeline and found that 30 were multimeric structures in solution. SAXS analysis allowed us to distinguish aggregated and unfolded proteins, define global structural parameters and oligomeric states for most samples, identify shapes and similar structures for 25 unknown structures, and determine envelopes for 41 proteins. We believe that high-throughput SAXS is an enabling technology that may change the way that structural genomics research is done.