创新参选：Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶

　　

2010实验室创新技术大奖评选活动开展半月以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目。不看不知道，原来大家在实验中还有这么多小技巧，小创意。从今天开始，生物通将刊登参选项目，与读者分享。如果您的实验也有类似的改进，别犹豫，赶快参选。无论是小改进，还是大创意，我们都欢迎。

据中国海洋大学的孙同学介绍，在Western Blot中可采用下列步骤消除内源的过氧化物酶。

项目：Western Blot中如何消除内源的过氧化物酶

背景：在Western Blot的显色中，常用的标记酶包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。其中HRP因特异性强、分子量小、稳定且作用底物范围广等优点而得到广泛使用。然而，某些细胞中存在大量线粒体，内源的过氧化物酶浓度自然比较高，它们可能会造成膜上出现一些“假的”条带。

方法改进：为了避免内源过氧化物酶对实验结果的影响，我们采用下列步骤来消除它。将制备好的胃壁细胞裂解液与上样缓冲液混合，上样到SDS-PAGE胶上。电泳之后，转膜。转膜之后，立即将膜放置在3% H₂O₂中，孵育15分钟。孵育之后，用TBS（25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）洗涤，之后用5%脱脂奶粉封闭。接着按照常规步骤进行下去。

结果：未用H₂O₂孵育之前，我们在膜上发现了一条约30 kDa的非特异条带。即使在不加一抗或二抗的情况下，依然在膜上显色，说明内源过氧化物酶存在。经过H₂O₂的孵育，这条带消失了。这种方法适用于线粒体较多的细胞（如肝细胞或中性粒细胞），能够让Western Blot的结果更加特异。

赛默飞世尔特约之2010实验室创新技术大奖评选活动火热进行中，五千元金奖等你拿！