创新参选：一种细胞稳定转染体系的建立

　　

2010实验室创新技术大奖评选活动开展半月以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目。不看不知道，原来大家在实验中还有这么多小技巧，小创意。从今天开始，生物通将刊登参选项目，与读者分享。如果您的实验也有类似的改进，别犹豫，赶快参选。无论是小改进，还是大创意，我们都欢迎。

据北京市肿瘤防治研究所的苏同学介绍，她是如此建立细胞稳定转染体系的。

项目：一种细胞稳定转染体系的建立

背景：在基因功能的相关研究中，稳定转染广泛运用于目的基因的真核表达。与瞬时转染不同，在稳定转染中，携带目的基因的质粒载体通过随机整合入细胞的基因组，使携带的目的基因得以稳定表达。由于整合是小概率事件，故通常运用载体上的抗生素选择标记来筛选出整合了目的基因而带有抗性的细胞。如pEGFP-C1稳定转染的表达载体中，neor基因作为选择标记，其编码的蛋白可以使细胞具有抵抗G418毒性的能力，通过此方法以G418毒性压力筛选出整合了外源基因的细胞。但是，在实践中发现，本方法并不能有效的筛选出带有目的基因的单克隆，实验中常见仅保留G418抗性，但是却不表达目的基因的单克隆，假阳性率可高达60%～80%（见结果实验数据）。究其原因可能由于质粒整合入基因组是随机的过程，故常常会有不完全的整合，即，抗性基因整合并表达而目的基因丢失。加之若neor基因与目的基因物理距离较远，则更有可能出现假阳性现象，严重影响了实验效率，使稳定转染体系的建立成为一项耗时耗力的困难工作。

方法改进：我们以pIRES-EGFP质粒为骨架，利用内部核糖体进入位点（IRES）作为连接，在其两端分别插入抗性筛选基因（嘌呤霉素抗性基因）与目的基因（绿色荧光蛋白EGFP），构建了pEGFP-IRES-Puro质粒，本质粒保证抗性基因与目的基因于同一mRNA上翻译，从而大大提高共同整合的几率。

结果：用此质粒转染BGC823及RKO细胞，分别以G418（其抗性基因在载体骨架上包含）和嘌呤霉素作为药物筛选，以EGFP表达与否来检测目的基因表达的阳性率。下表为两细胞系转染及不同药物筛选3周后，存活的单克隆在荧光显微镜观察的EGFP阳性率。括号中为阳性克隆数/克隆总数。可见，在嘌呤霉素的筛选下，EGFP（目的基因）表达的阳性率则高达88%和85%。而在G418药物压力下存活的单克隆中，存在EGFP（目的基因）表达的只有20%及36%，剩余80%及64%皆为假阳性。

	G418	嘌呤霉素
BGC823	20% (2/10)	88% (22/25)
RKO	36% (4/11)	85% (11/13)

结论：以内部核糖体进入位点IRES连接目的基因与抗性标记基因所构建的载体，可以大大提高共同整合表达的效率，从而适用于稳定转染的建立。

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