专访云南大学张克勤教授：仰望星空 脚踏实地

　　

生物通报道：科研的道路从来都不平坦，要想成功，除了对于科学的热爱，对于理想的执着，更多的是朝着目标脚踏实地，锲而不舍的精神，科学的女神总是青睐于那些即能仰望星空，又脚踏实地的人。来自云南大学的张克勤教授就是这样一位科学家，在漫漫研究长路上，他坚守着自己的信念，从不轻言放弃，在线虫生防研究等领域走出了自己的路。

 
（张克勤教授）

   张克勤教授研究组近期在细菌侵染线虫机制研究方面获得了重大进展，他们解答了细菌侵染线虫过程中的重要问题，提出了捕食关系中细菌的致病机理，这有助于科学家们进一步了解微生物侵染宿主机制，也对于研制新型生物防治方法具有重要意义。这一研究成果公布在《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。为了更深入了解这一研究成果，生物通特联系了张克勤教授，就读者感兴趣的一些问题请教了他。

有趣的“特洛伊木马机制”

   这篇题为“A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes”的文章讲述了一个有趣的故事：细菌首先会分泌出引诱线虫的芳香物质，通过一些伪装进入线虫体内，之后在线虫体内分泌毒力极强的胞外蛋白酶Bace 16和Bae 16侵染线虫，这个侵染过程和古希腊神话故事特洛伊战争中用于引诱敌人的‘特洛伊木马’策略具有异曲同工之妙。

   那么这项成果是如何取得的呢？张教授介绍说，我们从云南森林土壤40多份样品中筛选到5株具有杀线虫活性的细菌，其中，编号为B16的细菌显示最强的侵染线虫的能力，对其进行分类鉴定为芽孢杆菌属的一个新种，根据功能将其命名为杀线虫芽孢杆菌 (Bacillus nematocida) B16。以该菌为代表，具体研究了杀线虫细菌侵染线虫的机制：根据倒扣平板实验发现该细菌可以较强地吸引线虫，线虫误食该细菌后被细菌杀死并分解。

   之后也通过SPME/GC-MS找到了该细菌中作为引诱线虫的候选引诱分子，并通过纯品验证实验确定了7种引诱线虫的信号分子，其中六种引诱剂结构上都带有苯环，即均为芳香类化合物，虽然2-庚酮没有苯环，但与其他六种引诱剂一样，在低浓度下均可以散发出诱人的香味。完成与侵染相关的两个胞外蛋白酶的纯化、生化性质分析和纯酶的N-末端氨基酸序列分析，成功地克隆了这两个蛋白酶的基因。并对其做了系统发育分析，通过同源模建和生物信息学分析了两个毒性蛋白酶的三维结构。

   进一步利用原核表达载体pET30a分别将这两个毒力蛋白酶在大肠杆菌E. coli BL21中异源表达。通过同源重组，分别构建两个蛋白酶基因的单，双敲除突变株，测定各个突变株的蛋白酶活性和杀线虫活性，结果显示基因敲除突变株的杀线虫活性显著降低，证明了该细菌中的两个胞外蛋白酶为主要的毒力因子。并将两个蛋白酶在宿主菌中实现同源高效表达。分别用绿色、红色荧光蛋白对两个蛋白酶进行标记，示踪了两个蛋白酶侵染线虫的作用途径。利用显微注射统计实验证实毒性蛋白酶对线虫肠道的破坏是导致线虫死亡的主要因素；通过蛋白组学实验鉴定出这两个毒性蛋白酶降解线虫肠道的靶点底物蛋白。此外，初步实验证明该细菌吸引和侵染线虫是由细菌群体感应系统（Quorum-Sensing, QS）所调控。最后在土壤中，重现了细菌引诱并杀死线虫的机制。

“能吃虫的菌”与关键技术

   此次研究的对象是一种可以吃线虫的微生物，张克勤教授1986年就发现了这种细菌，并展开了相关的线虫生物防治研究。这项研究发现这种细菌的最大特点是当细菌感受到线虫后，它能模仿线虫食物的气味，产生吸引线虫的气味化合物。细菌是单细胞生物，当一些细菌感受到线虫后，它会通知其它个体同时产生这种吸引线虫的化合物，这一通讯系统是由细菌的群体感应系统所调控（QS），当将QS中的ComP和LuxS基因敲除后，则该细菌完全丧失了吸引线虫的能力（这部分内容未放到这篇已发的文章中，张教授研究组将另文发表）。至于这种新机制适用于多少种类的细菌，研究人员目前正在研究。

   在这项研究中，张教授研究组采用了多种方法，包括行为学实验方法，扫描电镜、透视电镜技术、基因功能研究方法与技术（克隆、表达、敲除、免疫荧光定位技术）、蛋白组学技术、挥发性化合物分离、结构鉴定技术、 显微注射技术等。其中最关键的技术是倒扣平板法确定细菌吸引线虫精巧体系，该方法由本课题组所发明，有可能成为研究由挥发性物质导致的吸引现象的典型实验。

研究团队

   作为云南大学副校长的张克勤教授不仅承担了多项科研任务，而且其行政身份也让他更加的忙碌，但是他认为这两者并不冲突，因为分管科研如果不在第一线，不了解国际和国家科研的发展趋势，也是很难做好科研管理工作的，科研管理与做好科学研究并不矛盾，两者应该相互促进。张教授也坦言道，当然从时间上来说会有些冲突，但只要把周末、节假日和晚上利用好，矛盾也不会太突出，这也是他们比别人要多些辛苦的原因所在，但只要做自己喜欢的事，就会乐在其中。

   在谈及多年的研究带给张教授最大的收获的时候，张教授自豪的说起了自己的研究团队，他说，这项有关细菌侵染线虫的特洛伊木马新机制的研究历时6年，许多人作出了极大的贡献，如博士生牛秋红，并列第一作者的黄晓玮教授等。在这6年的研究中，最大的收获就是建立了研究微生物与寄主相互关系的研究平台，培养了一支能干的队伍，为以后出更大成果奠定了坚实基础。
 

（张克勤教授研究组，照片来源：张克勤教授）

（生物通：王蕾）

原文摘要：

A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes

Understanding the mechanisms of host–pathogen interaction can provide crucial information for successfully manipulating their relationships. Because of its genetic background and practical advantages over vertebrate model systems, the nematode Caenorhabditis elegans model has become an attractive host for studying microbial pathogenesis. Here we report a “Trojan horse” mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes. We show that the bacterium Bacillus nematocida B16 lures nematodes by emitting potent volatile organic compounds that are much more attractive to worms than those from ordinary dietary bacteria. Seventeen B. nematocida-attractant volatile organic compounds are identified, and seven are individually confirmed to lure nematodes. Once the bacteria enter the intestine of nematodes, they secrete two proteases with broad substrate ranges but preferentially target essential intestinal proteins, leading to nematode death. This Trojan horse pattern of bacterium–nematode interaction enriches our understanding of microbial pathogenesis.

作者简介：

张克勤
教授，硕士/博士导师
云南大学生命科学学院微生物发酵工程重点实验室

学历

1981年2月 学士学位 (贵州农学院植保专业)

1989年7月 硕士学位 (贵州农学院植物病理专业/线虫生防方向)

1998年7月 博士学位 (中国农业大学真菌专业/食线虫菌物方向)

学术任职及杂志编委

1992年7月～2002年8月， 中国菌物学会理事

2002年9月～至今，中国菌物学会副理事长

2005年9月～至今，中国微生物学会理事。

Editorial Services:
  Editor in Chief (2001--) in Journal of Yunnan University
  Associate Editor(2000-2001) in Fungal Diversity
  Executive Editor(2002-2004) in Fungal Diversity
  Member of the Editorial Board(2009--) in Recent Patents on Biotechnology
  Member of the Editorial Board(2005--) in Mycosystema
  Associate Editor(2010--) in Mycology

代表论文和著作

1. Qiuhong Niu, Ziaowei Huang, Lin Zhang, Jianping Xu, Dongmei Yang, Kangbi Wei, Xuemei Niu, Zhiqiang An, Joan Wennstrom Bennett, Chenggang Zou, Jinkui Yang, and Ke-Qin Zhang*. 2010,  A Trojan horse mechanism of bacterial pathogenesis against nematodes. Proc Natl Acad Sci USA 107, 16631-16636.
2. Lianming Liang, Zhaohui Meng, Fengping Ye, Jinkui Yang, Shuqun Liu, Yuna Sun, Yu Guo, Qili Mi, Xiaowei Huang, Chenggang Zou, Zihe Rao, Zhiyong Lou and Ke-Qin Zhang﹡,  2010, The crystal structures of two cuticle-degrading proteases from nematophagous fungi and their contrbution to infection against nematodes The FASEB Journal 24:1391-1400.
3. Chu, Y., Niu, X., Wang, Y., Guo, J., Pan, W., Huang, X., and Ke-Qin Zhang*, 2010, Isolation of Putative Biosynthetic Intermediates of Prenylated Indole Alkaloids from a Thermophilic Fungus Talaromyces thermophilus. Organic Letters 12: 4356-4359.
4. Juan li, Li Yu, Jinkui Yang, Linqian Dong, Baoyu Tian, Zefen Yu, Lianming Liang, Ying Zhang, Xu Wang and Ke-Qin Zhang*, 2010, New insights into the evolution of  subtilisin-like serine protease genes in Pezizomycotina. BMC Evolutionary Biology  10:68(in press)
5. Chenggang Zou1, Huihui Tu, Xianyong Liu, Nan Tao, Wei Zhou, Ke-Qin Zhang*, 2010, PacC in the nematophagous fungus Clonostachys rosea controls virulence to nematodes. Environmental Microbiology. 12(7): 1868-1877.
6. Chenggang Zou, Nan Tao, Wenjing Liu, Jinkui Yang, Ziaowei Huang, Xianyong Liu, Huihui Tu, Zhongwei Gan and Ke-Qin Zhang*, 2010, Regulation of subtilisin-like protease prC expression by nematophagous fungus Clonostachy rosea. Environmental Microbiology. Doi:10.1111 /j. 1462-2920.2010.02296.x.
7. Chenggang Zou, Yongfang Xu, Wenjing Liu, Wei Zhou, Nan Tao, Huihui Tu, Xiaowei Huang, Jinkui Yang and Ke-Qin Zhang*, 2010, Expression of a Serine Protease Gene prC Is Up-Regulated by Oxidative Stress in the Fungus Clonostachy rosea: Implications for Fungal Survival. PLoS ONE 5(10):e13386.doi:10.1371/journal.pone.0013386.

获奖成果和名誉称号

1．"根结线虫生防真菌资源的研究与应用"获2004年国家科技进步二等奖，第1完成人；

2．"中国线虫生防资源研究与应用"获1994年贵州省科技进步一等奖，第1完成人；

3．"根结线虫生防菌剂的研制与应用"获2001年云南省科技进步一等奖，第1完成人；

4．“云南高原杀线虫微生物多样性”获2007年云南省自然科学一等奖，第1完成人；
5、“杀线虫微生物侵染宿主的分子机理”获2009年云南省自然科学一等奖，第1完成人。

6．2006年获何梁何利奖；1995年获"全国青年科技标兵"奖，全国优秀教师奖，享受国务院政府特殊津贴；2002年获"中国优秀青年科技创新奖"；2008年获首届谈家桢生命科学奖

主要研究兴趣

1．食线虫菌物

2．微生物分子生物学

3．基因与蛋白组学

对招收研究生的要求

专业背景：生物学
能力要求：勤奋努力
特殊说明：较好的英语阅读能力

治学格言

远大理想和切实可行的目标、持之以恒，锲而不舍精神、勤奋工作，求真务实的作风