Methods：胚胎干细胞培养（三）

　　

生物通报道：一个合格的ESC培养基的首要条件为促进ESC的永久性分裂增殖及维持ESC的未分化状态，前者是对ESC数量上的要求，后者是对功能的保证。选择最优化的细胞培养基对于ESC的研究及临床应用是至关重要的。生物通特总结了相关培养方法及一些产品，希望能帮助有这方面需要的研究人员找到更适合自己实验的培养方法。

3.无血清培养体系

在探索hES细胞培养的路上，很多研究组在进行建立hES细胞的无饲养层培养体系过程中，选择了两种策略，一种就是上一篇文章中提到的，用细胞外基质Matrigel，层粘连蛋白或纤连蛋白等包被的培养皿和CM。另外一种则是无饲养层细胞无血清的培养体系，即hES细胞培养在含血清替代物(serum replacement, SR)，并添加各种能促进hES细胞自我更新的生长因子的培养液中。

最开始的传统的hES细胞培养基配方大多需要胎牛血清，但这造成了一个异种血清蛋白的污染问题（血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利于 ESC未分化状态的维持），因此为了解决这个问题，科学家们提出了无血清培养体系，他们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液进行 ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明 ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基 。

在这方面，市面上的相关产品比较多，比如Invitrogen旗下的GIBCO就有一款替代血清的产品：KO-SR（Knockout™ Serum Replacement），这种产品可以有效维持hESC未分化的状态，而持续增长数目，这家公司在干细胞培养方面作出了很多努力，他们曾推出第一个培养间充质干细胞的无血清培养基STEMPRO MSC SFM，以及市场上首个完全限定、无动物来源成分的基质CELLstart，用于胚胎、间充质和神经干细胞的粘附与扩增，这些等等1200多种产品可以用于胚胎与成体干细胞研究流程的方方面面。

除此之外，Invitrogen也推出了定制的PD-Direct Bioprocess干细胞培养服务，这些服务有利于干细胞治疗的开发者降低无血清生产系统的风险，改进生产能力，并在干细胞培养基开发上提供所需的技能。

另外提到干细胞培养，就不得不说起mTeSR1，这是目前最常用的一种胚胎干细胞培养体系，也是出版发表文章中提及最多的一种培养配方，这种培养基是由加拿大StemCell公司优化了WiCell™ 研究所的一种配方——mTeSR™1培养液配方，在05，06年期间，Ludwig等人利用TeSR1和mTeSR1培养基成功的培养了hES细胞，其中TeSR1 培养基是一种化学成分确定的培养基：以DMEM/12F为基础，添加白蛋白，维生素，氨基酸，微量元素，脂类和某些特定的因子，比如bFGF，LiCl等。

而mTeSR1培养基则是在TeSR1基础上进行改进的一种培养基，这种培养基以zbFGF（来源于斑马鱼的bFGF）取代了hbFGF，StemCell公司将这种培养基产品化了，从而向市场推出了这样一种完全、成分确定的无血清培养液。在BD公司Matrigel™ 基质上，mTeSR™1可用于未分化状态hES细胞的维持和扩增，而不必添加其他生长因子。在mTeSR™1中未分化的hES细胞保持多能标记如Oct-3/4和SSEA-3的高表达。在畸胎瘤测定中，hES可分化成三种胚层的能力也证明了其多能性。

而且mTeSR™1和BD Matrigel™ 基质的结合使用可培养各种WiCell™ hES细胞系多至20代，因此mTeSR™1和hES适用的Matrigel™基质, 作为优质培养液与表面的结合，创造了一种完全的培养环境以支持hES细胞的无饲养层扩增，为hES培养提供了一种标准化的培养方法。

StemCell公司是一家颇具特色的干细胞研究产品公司，这家公司通过严格的质控保证每批次产品间的差异极小，并在2008年通过了ISO 13485:2003认证，使公司的产品可以应用于临床诊断。主要产品包括干细胞培养产品，细胞分选产品，以及标记抗体和细胞因子。

除了mTeSR™1，StemCell公司在胚胎干细胞培养体系方面还有mFreSR®、TeSR™2等，mFreSR®也是一种成分确定，不含血清的培养体系，主要用于hESCs和hiPSCs。

而TeSR™2则是mTeSR™1的升级版，这种成分确定的完全培养基，不含血清，不含动物蛋白，它是为维持hESC和hiPSC在未分化状态下的扩增而设计的。在加入添加剂后，完全的TeSR™ 2 培养基包含重组人碱性成纤维生长因子（rh bFGF）和重组人转化生长因子β（rh TGFTGFβ），不需要再额外添加生长因子。它能够与BD Matrigel™ hESC-qualified Matrix-coated surface（BD货号#354277）共同使用。另外，StemCell公司还推出了一种基于甲基纤维素的新型培养基-MethoCult Express，能够只培养7天就对总的克隆形成细胞进行囊化。

Thermo Scientific旗下的HyClone也提供了AdvanceSTEM系列干细胞培养产品，这种产品经实验证明，能促进小鼠胚胎干细胞的生长，多能小鼠胚胎干细胞具有非常显著的形态学特征，生长呈紧密簇状克隆，具有平滑的亮边界。而且AdvanceSTEM还有一种Serum Replacement，可以维护培养中小鼠胚胎干细胞的生长。

其它方面，Sigma-Aldrich公司推出了一种新型的干细胞培养基质：HyStem™ ，这是这是首个可定制的合成ECM（细胞外基质），能实现干细胞的3D培养。通过定制HyStem™ 平台，研究人员能控制生长因子、附着因子和ECM蛋白的掺入，水凝胶的硬度及细胞囊化等。由于HyStem是一种合成的基质，而不是生物提取物，所以研究人员能够密切控制细胞环境的组成。HyStem的成分包括化学合成的HyStem（thiolated Hyaluronic acid）、Extralink（硫醇反应性交联剂）、脱气（degassed）的水和生物纯化的Gelin-S（变性胶原）。HyStem水凝胶支架精密地模仿了自然的细胞外基质环境，同时提供了定制的灵活性，能加入适当的生长因子、附着因子和蛋白。

HyStem平台目前有三种。HyStem 细胞培养支架试剂盒是不含动物成分的，适合那些想要定制自己的附着因子和/或ECM蛋白的研究人员。HyStem C适合在干细胞培养中需要大量细胞附着位点的研究人员。HyStem HP则适合计划逐步向干细胞环境释放生长因子的研究。

 Methods：胚胎干细胞培养（一）
 Methods：胚胎干细胞培养（二）

（生物通：张迪）