Methods：胚胎干细胞培养（二）

　　

生物通报道：一个合格的ESC培养基的首要条件为促进ESC的永久性分裂增殖及维持ESC的未分化状态，前者是对ESC数量上的要求，后者是对功能的保证。选择最优化的细胞培养基对于ESC的研究及临床应用是至关重要的。生物通特总结了相关培养方法及一些产品，希望能帮助有这方面需要的研究人员找到更适合自己实验的培养方法。

2.无饲养层培养体系

尽管通过使用hES作为饲养层避免了异种蛋白的污染，但是由于饲养层的生长周期有限，制备比较繁琐，而且各批次细胞状态有差异，限制了hES细胞的大量扩增和稳定传代，另外也很难对在饲养曾上培养的hES细胞进行分子操作，从而限制了对hES细胞自我更新能力和全能性的分子机制等的研究，因此一些研究人员开始建立hES细胞的无饲养层培养体系。

目前已报道的主要有三种无饲养层培养方法：

以MEF的条件培养液作为添加成分，辅助以Matrix；
在培养液中加入TGFβ、LIF及 bFGF,辅助以Fibronectin；
通过使用特异性化学药物激活Wnt信号途径来维持ES细胞在无饲养层条件下的生长。

其中无饲养层培养方法最开始就是由获得多项干细胞专利的Melissa Carpenter等人在2001首次提出，这篇发表在Nature Biotechnology的文章提出了以MEF的条件培养液作为添加成分，建立了hES细胞无饲养层培养体系。在这之后又有科学家提出了建立长期无饲养曾培养hES的胚胎体系，添加LIF，Fibronectin等基质，其中Fibronectin可以增加细胞与培养皿的黏附，并可通过其受体Integrin激活一系列信号途径调节细胞的活动，包括细胞的增殖、凋亡和分化等。

在这些方面，市场上有一些颇具吸引力的产品，其中颇为有名的是在hES细胞研究领域处于领先水平的WiCell™ 研究所，这一位于威斯康辛州的研究所致力于增强和拓展hES细胞的研究，目前已和BD生物科学公司、StemCell公司建立了战略合作关系，共同开发人胚胎干细胞培养体系。

在此基础上，BD开发出了一种可以替代依赖于饲养层的hES细胞的，无饲养层基质：Matrigel™ 基质，这种基质是一种从Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠恶性肿瘤基膜分离的再生基膜，主要成分是层粘蛋白、IV型胶原和蛋白糖苷肝素硫酸盐，还包含了生长因子、基质金属蛋白酶等。BD公司在此基础上开发了一种更适合hESC生长的优化表面——Matrigel hESC-qualified Matrix，能与StemCell公司的mTeSR 1（将在后文提及）相匹配，为hESC研究提供了必需的重复性和一致性。

已报道的一些Matrigel™ 基质无饲养层培养体系组成（来自中南大学）：

Applied StemCell公司的ESC-Sure™则是一种添加了上述第二种方法里的bFGF的，bFGF其实是最通常的MSC培养基添加物，这种细胞因子能极大地提高细胞增殖能力，同时上调HLAI类分子、抑制HLA-DR分子的表达。hES要要维持多潜能性及低免疫原性的大规模体外增殖培养 ,除了要求血清的质量外 ,还包括其他培养因素的优化 ,如基础培养基、葡萄糖含量、谷氨酰胺稳定性、细胞接种密度及传代密度、培养板表面质量及重要细胞因子的添加等。

一些像是bFGF这样的细胞因子已被证实在维持干细胞全能性、未分化增殖方面有重要作用，不过研究也显示bFGF对MSC的分化潜能亦有影响，如有助于向成骨细胞系而抑制向神经细胞分化。

Applied StemCell公司（ASC）是一家提供干细胞研究方面产品的较新的公司，由干细胞研究专家领头，主要致力于发展新颖有效的干细胞研究产品，ESC-Sure™这种条件培养基采用的是无饲养层培养方法，能方便快捷的进行hES的培养，并且通过优化，能维持hES的多能未分化状态。

Tips（来自The Scientist）：

来自WiCell™ 研究所的Daisy Manning的建议——

10．避免“挑选保留”

Manning表示，如果一个研究者经常需要使用“挑选保留”的方法的话，那么他的操作可能有问题。“一般来说培养过程中每隔一代就要做一次挑选移除工作，这个时间段或许有小许误差，而且绝对不能打断分化过程。如果每隔一个月或每三个月就要做一次挑选保留工作的话，就有问题了。”

11． 别做完美主义者

Manning告诫说，过于频繁的挑拣会导致异常细胞出现，所以千万别做完美主义者。她补充说，也许研究者会看到培养板上有2%或3%的分化部分，那并不算什么，而且这些细胞团完全正常，但是如果每个月研究者都不停地进行挑拣，让培养基上完全没有分化的部分，那么很有后可能会导致产生诸如三体型12或17这样的异常现象。“所以不要过于热切。

12． 千万别用抗生素

“我们发现如果细胞培养方法和消毒手段都很完善，那么根本没有必要使用抗生素，” Manning说。此外，它们会严重地损害培养基。“你不知道在加入了另外一种成分后，它对胚胎肝细胞会产生什么样的影响。这些抗生素可能会导致异常细胞的产生。”

13． 别忘了染色体组型

WiCell研究院对第二十代和二十五代细胞进行染色体分类，这样来保证它们拥有正常基因。Manning说：“我们建议研究者在开始实验前就进行染色体分类，这样能够保证它们都处于正常状态。然后，在开始收集、发表大量数据时，一定要再次进行检查，而且我们认为在第五十代以后，每十代就要进行一次染色体分类。”

14．及早、经常冷冻细胞

Manning说，在解冻后尽快积累一些备用冷冻胚胎细胞，一旦研究者开始冷冻后，总是希望尽快完成这一过程，因为这样才能将传代细胞的数量降到最低。千万别等到细胞越来越多的时候才开始冷冻过程。细胞在能够分裂的前两天就应该冷冻起来，而到了第五天它们的生长最快，也最需要快速解冻。

15．这是一份全职工作

Manning强调说，人体胚胎细胞培养实际上并不清闲。培养鼠胚胎纤维原细胞与分裂培养人体胚胎细胞的过程就需要每周20小时以上的时间。这样，研究者就必须训练一个助手在自己生病或休假的时候来培养细胞。“一个人单独做这份工作实在是太费心了，所以一定要找个帮手，”她说。

Methods：胚胎干细胞培养（三）

（生物通：张迪）