纵观第三代测序之Pacific Biosciences[新品推荐]

测序竞赛愈发激烈。随着技术的不断改进，到底哪家公司能够首先冲过千元基因组的终点线呢？局势目前尚不明朗，但普遍认为第三代测序更有希望。生物通这次就向读者介绍几个第三代测序公司。第二站是Pacific Biosciences。

众所周知，天然的DNA复制本身就是一个非常高效且准确的过程。真核生物DNA复制的速度达几十个核苷酸/秒。若能以这样的神速测序，那可比Sanger测序快了几万倍。然而，知易行难。如何在不影响聚合酶活性的前提下实时观察DNA合成，这可是个棘手的问题。要知道，DNA聚合酶的直径只有15 nm。而且，这是一个涉及酶学、表面化学和检测光学的多学科难题。

早在10多年前，美国康奈尔大学的研究生Steven Turner和Jonas Korlach就开始为解决这一难题而做出不断努力。如今，Korlach和Turner创办了一家名为Pacific Biosciences（以下简称PacBio）的公司，并且终于将他们的想法转变成为现实产品。让我们看看他们主要克服了哪些挑战。

实时观察DNA聚合酶的主要挑战之一是如何能在DNA合成期间检测到单个核苷酸的掺入。因为在显微镜实时记录DNA链上荧光的时候，周围众多的荧光标记的核苷酸形成了非常强大的荧光背景。这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。正在他们一筹莫展之际，突然，微波炉门给了他们启发。微波炉门上的金属筛布满了小洞，它们比微波的波长要小得多。因此，这些洞能阻止微波通过并穿透玻璃。然而，波长更小的可见光就能够通过，让我们看到食物。他们的SMRT技术应用了相同的原理，不过规格就缩小至纳米级，称之为ZMW（zero-mode waveguide，零模式波导）。

ZMW是一个直径为几十纳米的小孔，它阻止可见的激光（波长大约为600 nm）完全透过ZMW。激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30 nm被照亮（下图）。在每个ZMW中，单个DNA聚合酶分子利用专利技术锚定在底部玻璃的表面。随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒，而单纯的扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度，类似于脉冲信号。因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。

测序是在专利的SMRT Cell中开展的，每个Cell中有一个阵列，上面有15万个ZMW。每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条不同的DNA样品链。每次运行能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。

Korlach与Turner还有一项重大发明。传统的核苷酸标记方法是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入DNA链中。这对于实时观察DNA合成也是有问题的，因为大分子的染料会干扰DNA聚合酶的活性，或造成聚合反应提前终止。因此，Korlach和Turner就开发出一种新型的核苷酸标记方法，即在核苷酸的磷酸链上进行标记，而不是碱基，这样，一旦核苷酸掺入到新生DNA链中，标记基团就会自动脱落。

当然，要将ZMW中的反应记录下来，还需要一台高精尖的仪器。PacBio RS于是诞生了，它能够实时开展、监控并分析单分子生化反应。PacBio RS使用一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集荧光所发射的光脉冲，观察整个过程；并使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ACGT碱基。一旦测序开始，实时的数据就传送到初步分析流水线，生成碱基身份和质量值。

以上三种新技术结合，就能让研究人员在短短的几分钟内对长片段DNA进行测序。它的速度、读长、灵活性和费用让其从第三代测序中脱颖而出。从样本制备到测序，所需的时间还不到一天。典型的测序运行时间低至30分钟。序列数据在几分钟之内就能产生，而不是几天，这对于传染病监控和分子病理学尤为重要。PacBio RS目前的读长超过1kb，比第二代测序要长得多。此外，试剂消耗和样本制备极少，不需要常规的PCR扩增，失误也大大减少，聚合酶动力学的直接观察赋予了测序之外的更多应用。凭借这些优势，PacBio今年被美国麻省理工学院（MIT）的《技术评论》（Technology Review）杂志评为全球50家最具创新力的企业之一。

一系列的文章也证明了SMRT技术。Korlach与Turner于2009年2月在《科学》杂志上发表了一篇介绍PacBio单分子DNA测序技术的文章。这篇文章代表了首个第三代测序技术的“原理验证”，因此引用率非常高。而后，他们又利用SMRT技术，直接测定了DNA的甲基化，这相对目前流行的第二代测序技术又前进了一大步。文章发表在今年5月的《Nature Methods》上。

荧光脉冲的到达时间和持续时间反映了有关聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。各种修饰对聚合酶动力学的影响不一，从而能够将它们区分开。研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合circular consensus sequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰（mA、mC和hmC）。研究人员还预计，其它的表观遗传学修饰，以及各种形式的DNA伤害，也能用这种方法检测。

看到这里，大家可能迫不及待地想知道PacBio的测序仪何时上市，价格多少。其实，PacBio RS已成型，目前正在早期试用阶段。今年2月份，PacBio宣布了10位北美的早期试用客户，包括贝勒医学院、冷泉港实验室、美国能源部联合基因组研究所、华盛顿大学基因组中心和斯坦福大学等等，并与第二季度开始发货。8月份，PacBio又迎来了它的首位欧洲试用客户，大名鼎鼎的Wellcome Trust Sanger研究院。

整个测序系统包括PacBio RS仪器以及专利的耗材。耗材部分包括SMRT Cell和试剂盒。PacBio RS上的每个反应消耗一个SMRT Cell。8个SMRT Cell包装成8Pac的形式。另外，他们还提供了三种试剂盒，用途各不同。Template Preparation Kit将DNA转化成SMRTbell文库形式。Binding Kit则将这个文库与聚合酶结合，为测序做准备。Sequencing Kit包含了实时测序所需的试剂。每个样本可在单个SMRT Cell上测序，也可根据项目需求在多个SMRT Cell中测序。因此，每个反应的价格取决于实验设计。

PacBio预计，到2013年，个人基因组的测序能在15分钟内完成，费用低于1000美元，人人都可以消费得起。说实话，2008年我第一次听到这个消息时，心中饱存疑惑，看来我实在是低估了PacBio的实力，也低估了测序技术发展的脚步。（生物通 余亮）