xCELLigence 系统内源性GPCRs细胞功能研究[创新技巧]

作者：
Jeff Irelan 美国圣地亚哥ACEA Biosciences 公司。

Jonathan H. Morgan 美国弗吉尼亚州Manassas ATCC 产品经理。

前言
G-偶联蛋白受体（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是当今临床与科研药物的单一治疗靶点，也是迄今发现最大的靶点家族。据推测人基因组中，该家族的功能成员超过300个，涉及多种不同细胞与组织间的广泛信号途径。研究证实，对GPCR功能的调节，有助于免疫学、神经病学、心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的治疗。

通过应用新的基于细胞水平的受体功能检测技术，候选药物对新调节子的确认率显著提高，损耗率（定义为临床前检测/临床试验失败率）降低。但基础研究获得的GPCR 功能数据很难被应用于临床疾病中。造成这种情况的原因是，传统细胞学实验往往（1）使用异源细胞，或相关性较低的细胞类型，进行人造受体的过表达；（2） 使用外源性检测试剂，如荧光标记试剂；（3）使用侵入性处理手段，像染料负载以及细胞裂解，（4）生成的数据仅为单一时间点的数据，而不是持续性细胞监测数据。

最近开发的生物相关性程度更高的实验系统，可显著改善 GPCR 药物开发与研究应用的成功率(1)。罗氏应用科学部的 xCELLigence 系统，不需要使用外源性标记，即可对疾病相关细胞的内源性GPCR功能进行实时评测。将细胞接种于含有微电极的培养板上，可对GPCR 激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定。

通过与细胞浆鸟嘌呤核苷结合蛋白或 G 蛋白结合偶联，GPCRs 可进行细胞的信号传导活动。所有主要的与 G 蛋白偶联的第二信使通路，都已被发现会激活环化AMP/蛋白激酶 A、钙离子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho 家族 GTP酶，使细胞发生形态学改变。而xCELLigence 系统可通过记录细胞阻抗，很容易对形态学改变进行检测(2)，从而完成对GPCR的检测。

与传统检测方法相比，形态学阻抗测定可对多个信号途径累积效应进行捕获。内源性GPCR 功能测定的优势包括（1）对靶受体进行评价是在其正常表达水平上；（2）在调节因子包括激素或异源性二聚体存在情况下，对受体之间的天然相互作用情况进行分析；（3）允许 GPCR 与细胞内 G 蛋白的天然偶联。同时，应用实时无标记xCELLigence 检测系统，可动态实时地记录实验期间的所有阻抗信息，从而对所有GPCR的反应进行检测。通过单一检测即可对 GPCR 激活导致的所有第二信使途径进行测定，从而有效降低试剂成本。

本研究中，我们发现 xCELLigence 系统是一种灵敏的、可靠的检测系统，用于持续内源性 GPCR 功能测定。研究中我们对涉及 24 个治疗相关受体家族的一组 43 个配体（参见表 1）进行了测定，并生成了相关GPCR功能图谱。实验涉及通用的肿瘤细胞系、HeLa、U2OS、SH-SY5Y 与 CHO-K1，以及 疾病相关的原代细胞：人血管内皮细胞与混合肾上皮细胞。

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目标家族	配体	HeLa	CHOK1	U2OS	SH-SY5Y	MREC	HUVEC
组织胺	组织胺
乙酰胆碱	卡巴胆碱
肾上腺素	异丙基肾上腺素
谷氨酸	L-谷氨酸
谷氨酸	（S）-3,5-DHPG
谷氨酸	（S）-MCPG
谷氨酸	DCGIV
谷氨酸	L-AP4
谷氨酸	LY342495
多巴胺	多巴胺
血清素	血清素
血清素	8-OH-DPAT-HBr
GABA	GABA
前列腺素	PGE1
前列腺素	PGE2
前列腺素	Iloprost
胰高血糖素	胰高血糖素
胰高血糖素	GLP-1
胰高血糖素	Exodus-2
CC 趋化因子	RANTES
CC趋化因子	MIP-3b
CXC趋化因子	AMD3 100
CXC趋化因子	SDF1a
降钙素	降钙素
黑素细胞刺激素	a-MSH
缓激肽	缓激肽
脑肠肽	脑肠肽
大麻素	花生四烯酸乙醇胺
大麻素	ACEA
内皮素	内皮素1
内皮素	[Ala1,3,11,15]-ET
溶血磷脂	LPA
溶血磷脂	S1P
溶血磷脂	SEW 2871
催产素	催产素
褪黑素	褪黑素
生长抑素	生长抑素
加压素	AVP
嘌呤	ATP
游离脂肪酸	GW 9508
游离脂肪酸	月桂酸
游离脂肪酸	乙酸
游离脂肪酸	丁酸

= 最大细胞指数值超出缓冲液对照的3倍标准差
= 最小细胞指数值低于缓冲液对照的3倍标准差

表 1：GPCR 功能图概述

材料与方法
细胞系与培养条件：细胞系来自于ATCC。按照 ATCC 的建议进行HeLa（#CCL-2）、U2OS （#HTB-96）、SH-SY5Y（#CRL-2266）、CHO-K1 （#CCL-61）、人血管内皮细胞（HUVEC；# PCS-100-010 批号 58570370）与混合肾原代上皮细胞（MREC；ATCC # PCS-400-012 lot # 58488854）的培养，肿瘤细胞系传代至 10 代以上，原代细胞系传代至 4 代。

检测程序：所有检测均于组织培养器（5% CO2，37°C ）中进行。细胞培养基为生长培养基，细胞接种密度是 1-2 x 104 细胞每孔，接种于96孔E-Plates 中，并通过xCELLigence 系统进行过夜监测，直至细胞生长至接近满板，复孔检测。预先在另一普通96孔板中每孔中添加 2 µl 药物，并储存于 -20℃。待细胞培养 18-24 小时后，进行药物稀释反应。将药物融解，并添加 132 µl 检测缓冲液（1 x HBSS，Sigma H8264、20mM HEPES，Cellgro 25-060-Cl、0.1% BSA，Fisher Scientific #BP1600）对其进行稀释处理。从培养箱中移除 E-Plates 96，使用检测缓冲液进行洗涤，洗涤一次，并使用Biotek MicroFlo Select，于每孔中添加 140 µl 检测缓冲液。将 E-Plates 96 放回至RTCA MP 站，放置15 分钟，进行细胞平衡。然后使用 Beckman Multimek 96，同时在各孔添加10 µl的药物缓冲液。小分子药物实验最终浓度为10 µM，多肽为1 µM。

数据分析：使用 RTCA 软件，对每孔的数据在药物添加前时间点进行标准化处理。对于各种药物，在计算时需减去只含药物溶剂时对照细胞表现出的背景值。小分子药物相应溶剂为DMSO，多肽药物相应溶剂为0.1% 的BSA 。

将检测结果数据导出至Microsoft Excel，进行后续计算。确定每孔细胞的最大与最小细胞指数值，计算重复检测（n=2）的均值标准差与平均值。对于对照孔细胞来说，对重复检测 8 个孔的均值标准差进行测定。将这些数值平均并乘以 3 以计算“hit”阈值。对于 Z 因子与 EC50 计算来说，使用RTCA MP提供的动态反应曲线，选择一时间点作为细胞系及药物综合反应的最佳时间点。

结果
为确保研究的重现性，细胞为可靠来源，并可确保细胞的质量与类别。所有实验细胞均来自于美国细胞菌种库（ATCC）。检测前，进行有限传代，按照 ATCC 的建议进行细胞的保存。

内源性GPCR检测稳定性。检测各种条件下HeLa细胞对内源性GPCRs激活剂的反应性。且将钙离子载体 A23187作为阳性对照，并对其进行检测。低浓度情况下，由于 Gq-偶联 GPCR 的激活，A23187可模拟钙离子的活化过程。由于其独立于GPCRs的表达，这种反应有助于细胞检测条件的研发。最强烈反应出现于过夜长满平板的细胞。此时使用 GPCR 检测通用缓冲液更换掉生长培养基（参见详细检测条件中的材料与方法）。

按照这些检测条件对几种不同细胞系对 A23187 与1-磷酸鞘氨醇（SIP）的反应进行评价，SIP 是无所不在的 GPCR 表达家族、溶血磷脂或内皮分化基因（EDG）受体的内源性激活剂。Z量测因子考虑有信噪比与检测的变异性，用于对检测强度进行评价(3)。使用终浓度 1 µM 或与缓冲试剂（0.1% BSA）相同浓度的 S1P 与 终浓度 100 nM 或与其缓冲试剂（DMSO）相同浓度的 A23187 对 8 个重复多孔培养的细胞进行处理。使用xCELLigence 系统，对细胞反应进行实时监测，间隔时间1分钟。

激活剂添加后最初几分钟期间，即开始检测细胞反应。每种细胞系中，添加激活剂后的最初 30-40 分钟期间细胞反应最大（参见图 1）。如图所示，处理后接近 30 分钟时，HeLa 细胞对A23187 的反应最大，对S1P 的反应接近最大。此时，A23187 与 S1P 的 Z 因子分别是0.83与 0.90。所检测的细胞类型中，两种处理中至少一种 Z 因子分值超出0.5，表明检测可靠性高（参见表 2）。相反，两种配体混合的原代肾上皮细胞（RMEC） Z 因子接近 0.25，表明检测可靠性不显著。但后续 GPCR 筛查检测结果表明，该细胞类型其他 GPCRs 可靠性更高。

图 1：GPCR 检测可靠性评价。HeLa 细胞接种密度是 10000 细胞每孔，接种于E-Plate 96 上，放置于xCELLigence RTCA MP 仪器，并在培养箱中过夜。然后去除生长培养基，添加检测缓冲液，持续细胞监测 15 分钟后，添加 GPCR调节药物，记录每分钟细胞反应情况，记录 1.5 小时。获得时间依赖性细胞反应曲线。八复孔，误差列代表均值标准差。药物添加后 30 分钟，计算单一时间点 Z 因子值检测质量。DMSO 是 A23187 试剂对照；0.1% BSA 用于 S1P。SD = 标准差；ABS = 绝对值。

图 2：GPCR 检测灵敏性评价。如图 1 方法，对 HeLa 细胞进行检测，每种药物以8个浓度处理细胞。使用 RTCA 软件，通过计算药物添加30分钟后每种药物的EC50值，对检测灵敏性进行测定。

内源性GPCR检测灵敏性。我们也使用 A23187 与 S1P，以及 8 点剂量反应曲线检测实验灵敏性（参见图 2）。于 Z 因子测定相同时间点，通过 RTCA 软件计算产生 50% 最大反应（EC50 值）的激活剂浓度。

每种细胞系的 EC50 值见表 2。每种细胞对 A23187 的处理均比较敏感，除CHO-K1外，所有细胞类型对 S1P 的处理均非常敏感，产生的 EC50 值低限为 10-7 至 10-9。尽管 CHO-K1 细胞表达EDG 受体(4)，后续检测S1P 与溶血磷脂酸（LPA）反应分值为阳性（见下文），但是为生成准确的 EC50，很明显，这里所用的剂量不足以饱和生物反应。

内源性GPCR功能图。优化检测参数后，使用治疗相关 GPCRs 的一组 43 个小分子与多肽调节子，对本研究中所用的细胞类型的功能反应进行检测（参见表 1）。该组药物指向的24 个受体家族，包括 50种潜在性反应受体，代表所有主要的 GPCR 偶联类型（Gs、Gi、Gq、G12/13）。使用上文程序进行复孔检测各细胞类型。

	S1P	A23187	S1P	A23187
细胞株	Z 因子	Z 因子	EC50	EC50
HeLa	0.90	0.82	1.4 X 10（-7）	4.8 X 10（-8）
CHO-K1	0.56	0.75	1.0 X 10（-6）	6.2 X 10（-8）
U2OS	0.52	0.73	3.1 X 10（-7）	3.7 X 10（-8）
SH-SY5Y	0.16	0.65	9.8 X 10（-9）	2.5 X 10（-7）
MREC	0.25	0.25	1.1 X 10（-8）	3.4 X 10（-9）
HUVEC	0.35	0.51	1.2 X 10（-8）	4.2 X 10（-7）

表 2：检测开发与评价概述

四种肿瘤细胞系HeLa、CHO-K1、U2OS 与 SH-SY5Y 对每种药物都会生成独特的时间依赖性细胞曲线（time-dependent cellular response profile，TCRP）（数据未显示）。我们对每孔最大与最小细胞指数值进行测定，该指数值与时间点无关，并以该数值均值与标准差作图（参见图 3）。GPCR 功能图表明，对能引发反应的配体而言，细胞指数值的增加或降低具有显著差异。例如，HeLa 细胞显示的细胞指数正向改变程度较大，CHO-K1 细胞显示的细胞指数负向改变程度较大，包括同样受体家族中的 GPCRs，如PGE1、2 与 Iloprost 激活前列腺素类受体（参见图 3）。这些结果表明，细胞背景差异可显著改变对同样刺激物的形态学反应，这可能是由于 G 蛋白偶联的差异，或下游信号传导途径的差异，这些差异可使细胞形态学发生改变。细胞指数值的总体模式同样也可反映出不同 GPCR 配体的相对特异性。SDF1a，即 CXCR4 内源性激活剂，仅可于 HeLa细胞中，诱导出强大的正向细胞指数反应，而降钙素仅可诱导出 CHO-K1 细胞的强大的负向细胞指数反应。我们也对两种附加肿瘤细胞系：SH-SY5Y神经母细胞瘤与 U2OS骨肉瘤细胞，以及两种原代细胞类型：人血管内皮细胞（HUVEC）与混合原代肾上皮细胞（这里简称 MREC）的 GPCR 配体进行检测。

为测定细胞系的相应活性配体，我们将 8 个对照孔的最大与最小细胞指数反应值与固有变异性进行比较。细胞指数值超出或低于对照孔细胞检测值的三个标准差的检测孔细胞被视为呈活性反应。配体诱导活性反应见图3 与 4。每种细胞相应内源性 GPCR 见表 1。

一种或更多细胞类型中，有14种受体家族被确认为活性反应。多种情况下，本研究中使用的内源性配体可激活同样受体家族的多个成员。例如，血清素可激活所有内源性血清素受体，包括几种亚家族，其中几种亚家族具有多种亚型。总之，研究证实，对一种或更多的肿瘤细胞，以及本研究所用的原代细胞中，xCELLigence系统细胞指数图是一种可靠的方式，可用于对 14 种不同 GPCR 家族进行功能检测。

= 缓冲液对照的3倍标准差
= 最大细胞指数超出缓冲液对照的3倍标准差
= 最小细胞指数低于缓冲液对照的3倍标准差

图 3：肿瘤细胞系 GPCR 功能图。指定类型细胞的检测如图 1 所示，于反应板单孔中，对细胞添43 个GPCR调节药物后的反应进行评价，并进行复孔重复。测定每孔最大与最小的细胞指数值（参见材料与方法）。使用 RTCA 软件，减去每时间点缓冲液对照孔的平均基线细胞指数值，从而对数据进行标准化处理（参见详细文本说明）。因此对照孔细胞指数值为零。误差列代表监测时间窗内培养孔的标准差。以反应孔的处理细胞的重复多个细胞指数值（两个重复多个反应板，n=2）均值作图。误差列代表重复多个细胞指数值的一个标准差。红色虚线代表对照孔的3倍标准差。明确导致细胞指数值增加（绿色线）或降低（红色线）的药物以实线框加强；无显著统计学意义的数据（低于3倍标准差-临界值）以虚线框显示。

图 4：原代细胞 GPCR 功能图。如图 3 所示，对指定细胞类型的原代细胞进行检测。

讨论
xCELLigence系统的实时无标记细胞检测技术可加速药物开发进程，并使基础研究成果更快的应用至临床中。我们的研究显示，通过 xCELLigence 系统，可对肿瘤细胞系与原代细胞的 GPCRs 功能进行检测。目前研究显示，一种或更多的细胞系中，检测的大多数受体靶 GPCR 家族可产生稳定反应，反应强度高于对照孔细胞均值的三倍标准差。以同样方式对多种细胞类型进行检测，除本文列出外，还可发现更多的内源性 GPCR检测数量。已检测的部分配体可激活 GPCR 家族多个成员。通过所选基因表达图的激动剂与拮抗剂附加实验，以及单一受体siRNA 敲除检测，可对xCELLigence系统检测到的，引发形态学改变的特异性受体亚型进行确认。

结论
• xCELLigence 系统可对广泛的内源性 GPCRs 功能进行检测。
• xCELLigence 系统进行的GPCR 检测，灵敏性与稳定性非常高。
• xCELLigence 系统进行的GPCR 检测GPCR 检测，可用于癌细胞系与原代培养细胞系。

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参考文献
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