IN Cell Analyzer 2000：让最具挑战性的高内涵分析高效完成[创新技巧]

IN Cell Analyzer 2000是一种全新的高性能成像系统，灵活地设计足以应对多种需求——从全自动显微镜到自动化的高内涵筛选。在此，我们展示了IN Cell Analyzer 2000在多个生物应用中的性能评测结果，说明了这个多功能系统产生了高质量的图像，适合于定量分析及提取准确、信息量丰富的数据。

Jeanette George, Albie Santos, Angela Williams, Rhian Martin, Val Millar*, Liz Roquemore & Gary Sarkis

英国英格兰白金汉郡安玛西亚镇通用电气医疗集团;电话：[phone];传真：[phone];e-mail: [e-mail]

摘要
药物开发的高内涵分析的本质在于：活性化合物在细胞、组织和整个生物体中作用，能够通过高通量荧光成像再加上自动化分析，来检测和定量那些相对于对照样品所发生的强度或者形态上的变化。IN Cell Analyzer平台提供了一整套从自动化图像获取到数据的定量和深度分析以及可视化的强大工具，来协助整个高内涵分析过程。IN Cell Analyzer 2000是一种全新的高性能成像系统，灵活地设计足以应对多种需求——从全自动显微镜到自动化的高内涵筛选。IN Cell Analyzer 2000提供了强大性能，如预览扫描、快速的载玻片成像、大芯片CCD照相机配件、3种透射光模式和高级图像背景噪音去除（去卷积）配件的选择，来确保提供在横向和纵向上定量最准确的图像。

我们展示了IN Cell Analyzer 2000在多个生物应用中的性能评测结果，说明了这个多功能系统产生了高质量的图像，适合于定量分析及提取准确、信息量丰富的数据。

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介绍
IN Cell Analyzer 2000是一个模块化的系统，包含了200W 宽视野照明源、8对激发和发射滤光片、一个4方位的自动化物镜转盘、10种可供选择的物镜及自动的校正环调整、3个自动的四波段多色分光器和标准或大的CCD照相机等多项选择。仪器的光路如图1所示。

图1. IN Cell Analyzer 2000的光路

就此次评估而言，仪器的配置包括所有8个激发和发射滤光片；分光器QUAD1和QUAD2；4×、10×、20×和40×尼康物镜；及标准芯片CCD照相机。

实验方法
全面评测包括多个表型各异的样品和检测的成像与分析，每一个代表了其本身的成像和分析挑战。我们展示了来自四个分析的性能评估的精选数据：(a) 神经生长 [1]，(b) GPCR受体内化 [2]，(c) 微核形成 [3]，(d) AKT1-EGFP和肌动蛋白成丝的多重分析 [4]。分析性能是通过一些指标来评估的，包括EC50或IC50，以及分析质量的指示剂如Z’ 和严格标准化平均差异（SSMD，[5]）。所得计算值都尽可能和已发表的结果来比对。

神经生长分析&预览扫描特征
神经生长在胚胎发育、神经分化和神经系统功能上扮演着重要的角色。高内涵神经生长分析能够直接筛选不同处理的形态结果。为了诱导神经生长，经血清饥饿的N2a细胞与递增浓度的视黄酸共同孵育。细胞固定、透化，并用抗- -微管蛋白的一抗和荧光染料（FITC、Cy3TM、Texas RedTM或Cy5TM）结合的二抗来染色。细胞核用HoechstTM 33342来染色。IN Cell Analyzer 2000获取的图像就特征分辨率而言，有着高的图像质量（图2）。

图2. 小鼠视网膜母细胞瘤Neuro-2a细胞用视黄酸处理来诱导神经生长后，利用IN Cell Analyzer 2000所获得的合并彩色图像。细胞体和神经用荧光染料结合的羊抗小鼠IgG标记，图示的例子为Cy5（红色）。细胞核用Hoechst 33342染色（蓝色）。成像条件：尼康 10× 0.45NA物镜以及与每个荧光基团匹配的滤光片组：350_50x & 455_50m (Hoechst)、490_20x & 525_36m (FITC)、543_22x & 605_64m (Cy3)、579_34x &_624_40m (Texas Red)及 645_30x & 705_72m (Cy5)。分光器QUAD1用于所有抗体，但Texas red除外，此时分光器切换到QUAD2。

在更高的药物浓度下，许多细胞逐渐分离，剩余的细胞集中在孔边缘。“预览扫描”特征能够对全孔进行快速预览，并在平板成像之前互动选择所需的成像位置(图3(a))，随后在IN Cell Investigator中以用户定义的步骤来分析图像库， 并对所有四种标记抗体的研究数据进行了比较(图3(b))。生成的剂量-反应曲线显示了每个实验皆产生了相当的动力范围、曲线形状和X-Y轴偏离位置。

利用CypHer5ETM来监测GPCR内化
GPCR代表了新药开发的重大机遇，也是大约三成处方药的主要靶点 [6]。GPCR受体的激动剂活化导致了细胞内从质膜到内体通路的内化。此过程可以通过pH敏感的荧光染料CypHer5E来观察，它在碱性pH下荧光最弱，而酸性pH下荧光最强（图4）。IN Cell Analyzer 2000产生的数据以及IN Cell Investigator中利用多目标分析模块（MTA）进行的分析得到了9.5的SSMD和0.63的Z’，这表明分析是可靠的，适于高内涵筛选。

图3. (a) IN Cell Analyzer 2000中预览扫描功能的利用能让用户优化成像位置，预览图像（4×）显示全孔区域的Hoechst染色细胞核，(b) 分析数据的图形一览显示出每个细胞中标准化的平均神经长度对视黄酸 (retinoic acid)浓度函数的曲线，利用荧光基团结合的羊抗小鼠IgG对处理的N2a细胞中抗-?-微观蛋白单克隆抗体进行染色，数据来自染料标记的羊抗小鼠IgG (a) FITC：峰[RA]=40 uM，SSMD=5.6；(b) Cy3：峰[RA]=30 uM，SSMD=6.9；(c) Texas Red：峰[RA]=30 uM，SSMD=7.6； (d) Cy5：峰[RA]=35 uM; SSMD=4.2。

图4. IN Cell Analyzer 2000利用20倍物镜、滤光片组350_50x & 455_50m (Hoechst)及 645_30x & 705_72m (Cy5) 所获得的图像，显示了异丙肾上腺素激动剂刺激后，VSV-G β-2肾上腺素受体在HEK293细胞中表达。受体内化的合并彩色图像是用CypHer5E标记的抗-VSV-G抗体以红色信号强度的增加来显示的（红色）。细胞核是以Hoechst 33342染色来显示的（蓝色）。(b) 显示了分析后的分段特征。(c) 数据显示；平均内含物计数/细胞+/-SD，n=48 孔?处理；SSMD=9.5 Z’=0.63。

微核形成 & 灵敏度提高
微核引入是遗传毒性化合物的关键生物标志物。对DNA链断裂或染色体分离干扰而产生的微核形成的快速自动分析，是候选新药毒理筛选中的重要组成部分。在这个例子中，用依托泊苷(etoposide)和丝裂霉素(mytomycin)来处理CHO-K1细胞以产生微核。固定细胞，用Hoechst 33342染色，并成像。系统的灵敏度让核通道的曝光时间只需18毫秒，在快速获取图像的同时提供宽广的灰度动态范围。两种处理及未处理群体的核图像都有着高的光学质量，显示出极佳的特征分辨率和整个视野中均一的低背景荧光（图5）。利用Investigator软件的微核分析模块来进行分析，报告每个处理组中微核和细胞数的百分比。本实验采用的细胞增殖及微核百分比的多重分析法 将死细胞或垂死细胞中的微核计数降至最低。数据显示了微核形成的药物依赖性增加，并伴随着细胞数的下降（图6）。在50%增殖时的微核百分比与发表的文献值一致 [3]。

图5. IN Cell Analyzer 2000利用20倍 0.45NA物镜、350_50× & 455_50m滤光片组、分光器QUAD2，对依托泊苷处理前(a)后(b) 的CHO-K1细胞所获得的图像，内图显示了微核相对母细胞核的放大图像。(c) 像素的线轮廓 vs视野内的灰度水平值显示了低背景荧光以及光照的均质性。

图6. CHO-K1细胞用递增浓度的(a)依托泊苷和(b)丝裂霉素处理，以诱导微核形成；剂量反应数据显示；平均值+/-SD，n = 8孔，每种浓度4个视野。

利用2D去卷积进行AKT1/肌动蛋白多重分析
AKT1-EGFP分析包含了稳定表达AKT1-EGFP融合蛋白的CHO母细胞系。当胰岛素样生长因子-1（IGF-1）刺激内源人胰岛素受体时，AKT1-EGFP发生转位，从细胞质移到质膜上的分散褶皱。PI3K/AKT通路的失调是癌症病理中的普遍现象，因此这条通路是治疗型药物开发的主要靶点。肌动蛋白是AKT的下游信号靶点。为了诱导EGFP-AKT1报告基因从细胞质转到质膜，细胞用IGF-1处理。在固定和用Hoechst 33342对细胞核进行染色之后，分析平板用IN Cell Analyzer 2000成像，并用IN Cell Investigator中的MTA模块进行分析。图像有着高质量，为转位事件发生后有效分离细胞核及细小的褶皱提供了足够的分辨率。激动剂的剂量反应滴定所产生的数据表现出典型的S形反应，而EC50与之前报道的数值相当（图7）[7]。

在进一步的实验中，对照和IGF1处理细胞用Tesxa Red标记的鬼笔环肽(phalloidin)来染色，以鉴定丝状的肌动蛋白（F-actin）。为了提高辨率和对比度，利用“2D去卷积获取”成像模式进行了高质量的图像还原。IN Cell Analyzer 2000成像平台提供了高级的图像还原配件，以确保获得定量最准确的图像。

图7. 稳定表达AKT1-EGFP的CHO-hIR细胞单独（对照）或与IGF-1（刺激）孵育在96孔Matriplate中，之后固定并用IN Cell Analyzer 2000在尼康 10×/0.45 NA 物镜、滤片组350_50x & 455_50m和490_20x & 525_36m、分光器QUAD2的条件下成像。细胞核用Hoechst染色（蓝色通道）；AKT1-EGFP报告基因在绿色通道发荧光。中间的图像，用IGF-1滴定 ；剂量反应曲线；每孔3个视野；平均+/-SD，每个数据点n=8重复。质量度量SSMD是利用最低和最高剂量点的数据计算而出的。

如图8所示，在去卷积图像中，能观察到目标的对比度和分辨率均有所增加，使分段特征增强。

图8. 稳定表达AKT1-EGFP的CHO-hIR细胞与IGF-1共同孵育，并利用40倍物镜、滤光片组350_50x & 455_50m, 490_20x & 525_36m, 579_34x & 624_40m以及分光器QUAD2在IN Cell Analyzer 2000上成像。细胞核用Hoechst 33342染色（蓝色通道）；肌动蛋白丝用Texas Red-鬼笔环肽染色（红色通道）；AKT1-EGFP则在绿色通道发荧光。(a) 在标准模式下获得的图像以及 (b) 利用“2D去卷积”模式对同一个目的区域获取的图像，内图对应了高光框的放大，应用用户定义的步骤来测量质膜褶皱和肌动蛋白成丝，强调了与(b) 标准2D成像模式相比，(a) 肌动蛋白丝的有效分段。

总结
一系列富有挑战性的HCA应用都已在IN Cell Analyzer 2000上评估。这其中包括神经生长、GPCR受体内化、微核形成和AKT1-EGFP活化及肌动蛋白成丝的多重分析。

IN Cell Analyzer 2000一系列全新的特征包括：预览扫描、大照相机配件、灵敏度增强和图像背景噪音去除（去卷积）等配置。这些特征使工作流程改善，提高了速度，并获得极佳的图像质量。

结论
IN Cell Analyzer 2000是一个多功能的用户友好系统，能够实现多个不同的生物学应用，并产生共聚焦一样的图像，对于高内涵分析应用可谓非常理想。

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参考文献
1. Application note, GE Healthcare, code number 28-9538-32 AA.
2. Application note, GE Healthcare, code number 28-9538-31 AA.
3. Ovechkina, Y; Content GenoTox Screening using IN Cell Analyzer 1000, presented at SBS 12th Annual Conference & Exhibition, September 17-21, 2006.
4. Application note, GE Healthcare, code number 28-9545-14 AA.
5. Zhang, D. H. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference highthroughput screening assays. Genomics. 2007; 89(4):552-61.
6. Physiological relevance of GPCR oligomerization and its impact on drug discovery. Drug Discovery Today (2008) 13:1056-1066.
7. Product brochure; GE Healthcare, code number 11-1114-03AA.
8. Wallace, W, Schaefer, L, Swedlow, J. R, A Workingperson’s Guide to Deconvolution in Light Microscopy, BioTechniques 31:1076-1097 (November 2001).