中国蛋白研究集中营：专访BPRC三位青年科学家

　　

生物通编者按：4年前北京蛋白质组研究中心BPRC在中关村生命科学园成立，成为了人类肝脏蛋白质组计划的国际总部。4年后BRPC更是秉承“求实、创新、卓越、和谐”理念，汇集青年人才，深入蛋白研究，在基础研究和产学研结合方面获得了进一步的发展。

近期BPRC取得了一系列的研究成果，生物通就此特采访了BPRC的三位青年科学家，就其研究的成果及技术等方面进行深入探讨。

姜颖副研究员课题组刘坤博士等发现乙型肝炎病毒相关疾病治疗的潜在靶点

乙型肝炎病毒（HBV）感染是一种严重危害人类健康的重大疾病，目前治疗手段有限，其重要原因是缺乏有效的治疗靶点。他们用先进的蛋白质复合体分离和鉴定方法，发现热休克蛋白HSP90和HSP70/HSP60形成的内源性分子伴侣复合体参与了HBV的复制及分泌，并用RNAi和小分子抑制剂证明它们可作为治疗HBV相关疾病的潜在靶点。此研究结果为系统了解HBV的生命周期及研发相关疾病的治疗药物提供了新的思路。

生物通：抗病毒治疗一直是乙肝治疗过程中的重要环节，但目前所用的抗病毒治疗措施均有其局限性。因此需要寻找新的，有效的治疗靶点，姜颖副研究员课题组是如何筛选到新的靶标蛋白？这些靶标蛋白在HBV病毒的复制及分泌过程中扮演了怎样的角色？

姜博士：我们通过一种分析蛋白复合体的方法叫做蓝色温和胶的技术，对肝癌细胞HepG2和整合有HBV全基因组的HepG2.2.15细胞同时进行分析，发现了特异存在于HepG2.2.15细胞中的蛋白质复合体。通过对这一特异蛋白质复合体进行成分鉴定和进一步的功能验证（抗体超迁移实验证实特异存在于HepG2.2.15细胞中的蛋白质复合体存在的真实性，RNAi和小分子抑制剂分别证实了潜在靶标的敲低确实降低了HBV的复制及分泌，但并没有影响细胞本身的增殖和凋亡) ，我们筛选到新的潜在靶标蛋白。这些潜在的靶标蛋白在HBV复制和分泌中，具体扮演怎样的角色，仍需进一步深入研究。

生物通：热休克蛋白HSP90和HSP70/HSP60形成的内源性分子伴侣复合体不仅参与了HBV的复制及分泌，也在机体正常功能方面起到了重要作用，作为潜在的治疗靶点，如何能做到特异性靶定？

姜博士：我们对细胞内的HSP90、HSP70进行敲低的同时，发现HBV的产出减少了，但细胞的增殖和凋亡并没有受到影响。当然，作为真正的治疗靶点，仍有很长的路要走。

生物通：热休克蛋白本来是帮助细胞抵抗外界不良的物质，在感染HBV的细胞中是不是被HBV劫持利用了，您能详细谈谈吗？

姜博士：应该说是被HBV劫持利用了。病毒以很小的基因组来编码小量的蛋白，但可以完成很复杂的功能，这就需要病毒劫持宿主细胞的蛋白来行使某些功能。

生物通：在HBV研究过程中，采用的蛋白质复合体分离和鉴定方法具体是指什么？与一般的蛋白分离技术有何区别？文章中用RNAi等的治疗试验是指的细胞实验还是动物实验？如果是动物实验，具体是哪种动物？

姜博士：蛋白质复合体的分离采用的是蓝色温和胶技术（blue native gel），蛋白质鉴定采用的是串联质谱。蓝色温和胶技术可以在不添加SDS的情况下使蛋白带上负电荷，从而可以在不破坏蛋白复合体的情况下完成电泳迁移。文章中用的RNAi是细胞实验。

生物通：目前预防乙肝的主要方法是接种疫苗形成抗体，但是近四成成人在接受了多次疫苗注射后却查不到抗体，您能从专业的角度进行下解释吗？

姜博士：目前对乙肝的治疗，尚没有特效手段，但乙肝疫苗研制成功后，使得我国乙肝发生率大大降低。接种乙肝疫苗后，机体是否获得对乙肝病毒的免疫力就显得尤为重要。如果接种了乙肝疫苗，但却不产生抗体可以从机体免疫力和疫苗的剂量两方面找原因。免疫力低下或注射疫苗的剂量偏低的情况下，可以通过加大乙肝疫苗注射的次数或疫苗剂量，可以提高免疫效果。但如果机体已经发生了隐匿性的感染，多次注射疫后仍不能产生抗体。

 

朱云平研究员课题组张纪阳博士等大幅提升蛋白质组质谱数据的利用率

大规模、高通量的蛋白质组研究产生了海量的数据，其中包含了大量的噪声，而高可靠的数据是进一步生物学分析的基础，故目前的分析方法均采用了过严的标准，但在降低假阳性的同时也人为地造成了数据较高的假阴性及较低的利用率。因此，“在保证高可信度的前提下，最大限度地利用实验数据”一直是蛋白质组学界的追求。“鸟枪法”是目前蛋白质组鉴定中地位最重要、应用最广泛的技术策略。他们基于随机数据库策略、非参概率密度模型和贝叶斯公式，建立了串联质谱数据过滤的多元贝叶斯非参模型。通过标准蛋白和复杂样品的严格考核，表明该模型具有良好的灵敏性和普适性，可将质谱数据的利用率提高10~40%，创本领域最好水平。

生物通：质谱技术是蛋白质组学研究中的一种重要工具，但是这种技术也存在一些缺点，您能具体谈一下这些缺陷是什么吗？

朱博士：质谱技术是蛋白质组研究的核心技术之一，用于蛋白质组研究的质谱仪是一个复杂的系统。由于蛋白质组研究需求的促进，质谱技术在精度、灵敏度等方面有了重大提升，质谱系统自身也越来越复杂。但是蛋白质组样品的高动态范围和随时间变化的特点，使得质谱技术的进步还不能满足蛋白质组的研究需要：高精度和高通量之间的矛盾一直是质谱仪器面对的问题；质谱数据中包含大量的噪声，现阶段还没有合适的模型来对噪声建模，使得从数据中得到的模型受到噪声的干扰，大大降低了质谱数据的利用率；样品和仪器系统自身的复杂性给质谱数据的分析带来了一定的困难；尚未建立具有普遍意义的"正确"和"完备"的质谱数据分析标准和流程。

生物通：目前经常使用的质谱预测模型都比较简单，而且一些算法在蛋白质鉴定方面并不令人满意，您的"多元贝叶斯非参模型"有哪些突破呢？比如说是如何解决高背景噪音的问题？

朱博士："多元贝叶斯非参模型"既不是质谱预测模型也不是用于蛋白质鉴定的算法。我们所发展的"多元贝叶斯非参模型"是改善鸟枪蛋白质组串联质谱数据鉴定肽段质控的方法，该模型最大的特点在于，不依赖于经验分布估计和特定的训练集数据，我们基于随机数据库策略和非参概率密度函数对每一个数据集本身拟合判别函数的系数，以及描述正确结果和随机匹配结果的分布，并利用贝叶斯公式得到每个匹配正确的概率。该模型可以较好地减少噪声图谱干扰，对多来源、多类型的质谱数据都有很好的适用性。

生物通：鸟枪法确实是目前蛋白质组鉴定的强有力工具，相比于另外一种相反的方法：Top-Down，鸟枪法的优势在哪里呢？

朱博士：鸟枪法（Bottom-up）相对于Top-Down（主要是基于2DE的方法），最大的优点是简化了样品处理的过程并且增加了最后总的数据产出，鸟枪法蛋白质组学和数据库搜索结合来鉴定蛋白质，可以满足蛋白质组学研究高通量、自动化的要求。另一方面，它减少了实验处理过程造成的样品蛋白质的丢失，让研究者鉴定了大量在二维凝胶蛋白组学中无法鉴定到的蛋白，如血浆膜蛋白以及一些和制药以及生物技术高度相关的靶群，例如：转运体、离子通道、G蛋白偶联受体，以及其他一些受体。

 

钱小红研究员课题组合作发现亨廷顿疾病潜在生物标志物。

该研究以患者脑脊液为样本，通过6国实验室合作，规模化筛选和鉴定与亨廷顿疾病(HD)发生、发展密切相关的蛋白质。通过对基因组和蛋白质组数据的整体研究发现，人脑脊液中可检测到的在脑中高表达的蛋白（脑特异性蛋白）是血浆中的1.8倍。与正常人脑脊液相比，HD患者脑脊液中的脑特异性蛋白含量呈下调趋势，其中81%的蛋白量变与不同脑区mRNA转录水平变化一致，同时发现HD患者脑脊液中的肝相关蛋白含量上调。脑脊液中高表达的蛋白大多与免疫系统相关，这些蛋白的变化与HD特征性的神经退行性变、小神经胶质细胞增生和星形胶质细胞增生现象相吻合，提示其可作为HD的潜在生物标志物。

生物通：亨廷顿疾病是一种遗传性神经系统变性病，虽然早在19世纪就对其进行了临床描述，但是目前还没有任何药物可以改变亨廷顿病的自然病程，您这项研究比较于之前的亨廷顿疾病药物筛选，有何突破？

钱博士：本研究是一项国际合作项目，采用比较蛋白质组的研究策略，通过不同国家实验室采用不同技术体系对相同样本的系统分析，初步揭示了在正常和亨廷顿病条件下脑脊液蛋白质表达的变化规律，发现了一批在疾病条件下表达变化的蛋白质，为深入探讨亨廷顿病的发病机制，筛选重要功能蛋白质及治疗药物的靶标提供了重要信息。

生物通：您在这项研究中发现了一种脑特异性蛋白，在进行分析检测的时候，收集了多少临床数据？这种蛋白表达量降低引发哪些病理病理变化？除了做生物标记，这种蛋白还可能作为潜在治疗靶位吗？

钱博士：本研究发现在人脑脊液中检测到的高表达的蛋白（脑特异性蛋白）是血浆中的1.8倍。与正常人脑脊液相比，HD患者脑脊液中的脑特异性蛋白含量呈现下调趋势，且其中81%的蛋白量变都可以验证到在HD患者脑中不同区域的mRNA转录水平发生了变化。研究采用了20例亨廷顿病人样本和10例正常对照样本。对亨廷顿病样本中含量下降的脑特异蛋白质与疾病的关系以及作为治疗药物的靶标的研究有待展开。

生物通：目前亨廷顿病已经有了非人灵长类模型，您这项研究是否准备进行相应的模型研究？

钱博士：目前暂时没有准备进行模型研究。

生物通：您在这项研究中采用的规模化筛选和鉴定是指什么？能谈一下规模化筛选和鉴定的技术心得吗？

钱博士：本研究采用了目前国际上通用的比较蛋白质组学的研究策略，利用本课题组建立的N－端乙酰化同位素标记－液相色谱－傅立叶离子回旋共振质谱联用技术，以及自主研发的数据分析软件，对亨廷顿疾病样本和对照样本进行蛋白质组比较分析，鉴定差异表达蛋白质达到355种，证明我们的技术体系是成功的，与国际上参与本研究的实验室相比，数据规模和数据质量都是相对领先的。

生物通：北京蛋白质组研究中心发展迅速，如何给人才创造好的研究环境和氛围呢？另外在新医药产业化方面是否也获得了突出成果

答：中心自建立以来，秉承“求实、创新、卓越、和谐”理念，在贺福初院士的带领下，在“建设国际一流的集蛋白质组科学研究与开发、技术创新、人才培养、成果转化、信息交流与技术服务于一体的国家级研究中心和基地”的目标指引下，一些年轻学者们聚集在中心，潜心做研究，定期讨论进展，交流心得。一方面为科学家做研究提供机会，鼓励创新，奖励成果；另一方面在住宿、饮食等生活的各方面提供尽可能的便利，使科学家可以安心做科研。基础科学的出路在应用。一方面，中心利用目前所有的硬件条件，为国内外的企业、科研院所提供技术服务支持；另一方面，坚持自主创新，从源头上突破。近期一课题组研究发现特异性调节p53介导凋亡的蛋白，文章发表在Nature Cell Biology上。虽然，从基础走到临床，实实在在的造福于患者，要走的路还很长。但是，我们会一直努力，所有基础研究者都会努力。

（生物通：王蕾）