凋亡：细胞的绝唱（下篇）[创新技巧]

近二十年来，随着现代分子生物学技术的应用，细胞凋亡领域取得了飞速的进展，从而让我们能更深入地了解凋亡的分子机制，以及凋亡与疾病的关系。本文将对细胞凋亡领域做一个技术回顾。上篇介绍凋亡的发现史，它与坏死、自噬的关系，以及细胞为什么会凋亡；下篇将重点聚焦细胞凋亡的机制。凋亡检测方法也即将出炉。

凋亡：细胞的绝唱（上篇）

外部途径

外部途径的活化是通过特定的死亡配体（如Fas配体、TNFα和TRAIL）与细胞表面的死亡受体（肿瘤坏死因子超家族成员）的相互作用而介导的。尽管不同死亡受体激活的信号通路存在一些差异，但大致的凋亡信号通路是类似的。死亡配体与受体的结合导致神经酰胺的产生。神经酰胺的释放被认为促进了脂筏的融合，让死亡受体大规模聚集。这种聚集放大了凋亡信号。虽然在某些细胞如淋巴细胞中，不发生受体聚集，也能引发凋亡，但在大多数情况下，信号通路的放大是激活整个凋亡反应所必需的。

配体结合之后，受体的胞内结构域发生了构象变化，暴露出“死亡结构域”，并招募不同的凋亡蛋白。这个形成的蛋白复合物被称为DISC（诱导死亡信号复合物）。最后一个步骤是招募到一种caspase，通常是caspase-8前体，导致caspase-8的激活和凋亡的起始。

TNFα与受体TNFR-1的结合导致受体的三聚化以及胞内死亡结构域的聚集。TNFR-1变构后，招募到一种胞内的接头蛋白TRADD（TNFR-associated death domain）。TRADD随后招募到多种不同的蛋白，如下游的TRAF2（TNF-associated factor 2），并激活NF-kB和JNK通路。TRADD也能与FADD（Fas-associated death domain protein）结合，并通过蛋白间相互作用招募到caspase-8前体，形成DISC。在DISC形成过程中，caspase-8前体自动裂解成有活性的caspase-8，并释放到细胞质中，起始下游的级联反应。FADD参与的凋亡通路被FLIP（Flice-inhibitory protein）所抑制。FLIP是一种缺乏蛋白水解活性的caspase-8同源近似物，通过抑制FADD与caspase-8前体的相互作用从而抑制凋亡。

Fas的配体（FasL或CD95）激活凋亡的途径与TNF类似。配体的结合促进了受体的聚集、DISC的形成以及caspase级联反应的激活。不过，Fas受体的信号通路更简单些。接头蛋白FADD直接与Fas受体的死亡结构域结合，而无需TRADD的参与。Fas受体似乎只在凋亡中发挥作用，而不像TNF受体一样参与其他的信号通路。同样，这个过程也被FLIP所抑制。

在对Fas应答的细胞中，一型细胞（type I），如胸腺细胞，其caspase-8有足够的活性，被Fas活化后导致细胞凋亡，在这类细胞中高表达的Bcl-2不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在二型细胞（type II），如肝细胞中，Fas介导的caspase-8活化不能达到足够的水平，因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途径来放大。活化的caspase-8将胞质中的Bid剪切，形成活性分子tBid（truncated Bid），tBid进入线粒体，导致细胞色素c释放，使凋亡信号放大。

在很多细胞内，TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）能与受体DR4或DR5结合，引发快速的凋亡。不过有意思的是还存在一些诱骗受体，与DR4和DR5受体竞争。这些诱骗受体称为DcR1和DcR2。它们都能与TRAIL配体结合，但是不会起始凋亡，因为DcR1没有胞内的结构域，而DcR2的死亡结构域截短了，招募接头蛋白所必需的6个氨基酸中有4个缺失。

NF-kB是凋亡的抑制剂。通常NF-kB与抑制蛋白IkB结合，存在于胞质中。在TNF的诱导下，IkB被磷酸化，随后被泛素降解。而自由的NF-kB二聚体被释放，并转位到细胞核中。NF-kB诱导了一系列基因的表达，如FLIP、cIAP1和cIA2等，而这些表达产物抑制了凋亡。凋亡抑制蛋白XIAP（X-chromosome-linked IAP）也由NF-kB调节，它通过BIR结构域和NH2末端接头抑制了caspase-3和-7，从而抑制凋亡。

内部途径

凋亡内部途径是脊椎动物最普遍的细胞死亡途径，能被多种刺激因素活化，包括生长因子撤退、热休克癌基因激活、DNA损伤剂、活性氧、胞内钙离子过多及其他的细胞应激。这些因素导致线粒体外膜透化，及一些促凋亡蛋白的释放，如凋亡诱导因子（AIF）、细胞色素c、Smac/DIABIO等。细胞色素c从线粒体中释放出来不依赖于线粒体膜表面电位下降和线粒体膜通透性的增加。Smac/DIABIO是凋亡抑制蛋白XIAP的抑制因子。而AIF不依赖caspase途径，同样诱导细胞凋亡。它进入胞浆之后被转运到细胞核中，或许是与核酸内切酶G一起，引发染色质的凝集和高分子量DNA（50 kb）的片断化。

细胞色素c从线粒体中释放出来是凋亡中的大事件。一旦细胞色素c释放到胞浆，它就与凋亡激活因子Apaf-1结合，并进一步招募到caspase-9前体，形成多蛋白复合物，称为凋亡小体（apoptosome）。活化的caspase-9进一步导致下游的caspase-3及caspase-7的活化。

线粒体外膜通透性的增加是由于膜通透性转换孔（PTP）的改变或经Bcl-2家族中促凋亡分子活化。PTP复合物主要由位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道（VDAC）、位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白（ANT）以及线粒体基质中亲环蛋白D（cyclophilin D）组成。胞浆内高水平的钙离子能触发PTP的开放，使得水分子及1.5 kD的溶质分子从胞浆自由扩散到线粒体基质，导致线粒体肿胀及跨膜电位的崩解。线粒体外膜通透性增加的另一种机制就涉及到Bcl-2家族。

Bcl-2蛋白家族分成两派，Bcl-2和Bcl-XL是抗凋亡蛋白，而Bad、Bax及Bid是促凋亡的。细胞对凋亡刺激的敏感性依赖于这两派之间的平衡。当促凋亡蛋白过量时，细胞对凋亡敏感。反之，当抗凋亡蛋白过量时，细胞更倾向于有抗性。线粒体表面过量的Bcl-2促凋亡蛋白被认为是PTP形成的重要因素。

Bcl-2家族中的促凋亡蛋白时常在胞浆中巡逻，它们充当了细胞损伤或应激的感应器。在细胞应激时，它们转位到线粒体表面抗凋亡蛋白的所在点。促和抗凋亡蛋白的相互作用破坏了抗凋亡蛋白的正常功能，导致PTP的形成和其他分子的释放。于是又导致了凋亡小体的形成和caspase级联反应的激活。

Bid还是联系死亡受体和线粒体途径的纽带。Bid通常以无活性的形式存在于细胞质中，被激活后转位到线粒体膜上，与抗凋亡Bcl-2蛋白对抗，促进凋亡。在某些细胞类型中，Bid在死亡受体激活后由caspase-8剪切，形成活性分子tBid。tBid快速结合到膜上，之后tBid与Bax相互作用，导致Bax插入膜中，并寡聚化，膜开始变得有通透性，接下来细胞进入凋亡程序。Bcl-XL可阻止tBid与Bax结合，抑制细胞凋亡。Bid还能由其他酶如颗粒酶B和溶酶体的蛋白酶激活。

凋亡过程的主要执行者

Caspase是凋亡过程的主要执行者之一。它们属于半胱氨酸蛋白酶，在细胞中以无活性的酶原形式存在。在凋亡过程中这些酶原被切割，形成具有活性的酶。凋亡的外部途径会导致caspase-8或caspase-10的激活。这些caspase在级联反应中激活其他的caspase。级联反应最终导致效应caspase如caspase-3和caspase-6的激活。效应caspase负责切割关键的胞内蛋白，如细胞骨架蛋白，导致细胞发生典型的形态学改变。

Caspase-3被认为是最重要的执行者，它由上游的caspase（caspase-8、caspase-9或caspase-10）激活。Caspase-3特异性地激活核酸内切酶CAD（caspase activated DNase）。在增殖细胞中，CAD通常与ICAD（CAD的抑制剂）组成没有活性的复合物。在凋亡过程中，ICAD被caspase-3切割，释放出CAD。随后出现DNA的迅速片断化。

除了死亡受体之外，caspase级联反应的激活还存在其他机制。颗粒酶B（Granzyme B）也能由细胞毒性T淋巴细胞运送至细胞内，并直接激活caspase-3、7、8和10。线粒体也是caspase级联和凋亡的关键调节器。线粒体中释放的细胞色素c能导致caspase-9，继而是caspase-3的激活。这个过程通过凋亡小体的形成来调节。

多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）是最早鉴定出的caspase的底物。PARP通过催化多聚（ADP-核糖）的合成，与DNA链的断裂结合并修饰核蛋白，参与了DNA损伤的修复。caspase-3能切割PARP，从而阻止其修复。核纤层蛋白（Lamin）是维持细胞核形状，并调节染色质与核膜间相互作用的核内蛋白。caspase-6对核纤层蛋白的降解会导致染色质凝聚及核片断化。

尽管我们一直以来都将目光聚焦在凋亡和caspase上，但它们并不能代表一切。在清除有瑕疵或存在潜在威胁的细胞方面，还有其他酶在执行着程序性细胞死亡，包括钙蛋白酶（calpain）、组织蛋白酶（cathepsin）、核酸内切酶及其他蛋白酶。它们在一些细胞器如线粒体、溶酶体和内质网的指导下，独立上阵或通力合作。这些非caspase介导的细胞死亡途径，在caspase途径失败的时候，同样能成为生物体的守护天使，并为癌症治疗带来曙光。（生物通 余亮）

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