专访Cell文章作者 解密蛋白技术

来自约翰霍普金斯大学医学院高通量生物学研究中心等处的研究人员利用酵母蛋白质组芯片识别并确认了许多NuA4复合物必需核小体乙酰转移酶的非染色质底物，证明了NuA4复合物能通过乙酰修饰一种关键的代谢酶完成糖代谢和生命周期的调控功能。这一重要的研究成果公布在《Cell》杂志上。为了更深入的了解这一研究的意义及技术手段，生物通采访了文章的通讯作者：朱衡（Zhu Heng）博士，就读者感兴趣的问题请教了他。

　　

生物通编者按：2009，已渐行渐远，生命科学的精彩还在继续演绎。一个新的发现可能创造一个全新的研究领域，一个新的发现可能彻底颠覆经典理论，每一位科学家都是生命科学领域的弄潮儿，他或推动着生命科学深刻地变革，或默默填补生命科学认识的鸿沟。2009年，点亮生命之光的是谁？奏响生命之歌的是谁？关注他们，关注赛默飞世尔特约之2009年度生命科学十大风云人物评选！

 

组蛋白乙酰转移酶HATs和组蛋白去乙酰酶HDACs是两种重要的生物活性酶，在生物体中通过与非组蛋白底物相关作用扮演着许多重要的角色，但是目前研究发现的只是酵母中染色质相关的非组蛋白底物。近期来自约翰霍普金斯大学医学院高通量生物学研究中心等处的研究人员利用酵母蛋白质组芯片识别并确认了许多NuA4复合物必需核小体乙酰转移酶的非染色质底物，证明了NuA4复合物能通过乙酰修饰一种关键的代谢酶完成糖代谢和生命周期的调控功能。这一重要的研究成果公布在《Cell》杂志上。

为了更深入的了解这一研究的意义及技术手段，生物通采访了文章的通讯作者：朱衡（Zhu Heng）博士，就一些读者感兴趣的问题请教了他。
 
生物通：组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶是两种重要的功能酶，酶本身和底物的相关研究近年来倍受关注，您的这项研究成果的突破点在哪里？

朱博士：这项研究成果有几个方面的突破，首先这是首次成功利用酵母蛋白质组芯片识别乙酰转移酶复合物的底物，其次这项研究识别和确定了许多非染色质底物，第三，研究发现糖异生途径中一种关键酶：PEP羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxy kinase）的乙酰化对于其酶活性具有重要意义，第四，我们发现这种酶Pck1是Sir2的直接靶标，从而解释了Sir2（人类去乙酰同源物SIRT1）如何在饥饿状态下维持酵母细胞的寿命，最后，这项研究也提供了这些调控在人体中的保守性的直接证据。

生物通：贵研究组在实验中主要采用了酵母蛋白质组芯片技术，您能具体介绍下选择这种技术的原因吗？（即这种技术相比于同类技术的优点和缺点）

朱博士：蛋白芯片技术最重要的应用之一就是检测蛋白翻译后修饰PTMs的分子机制，其中最重要的一步就是识别不同类型酶的底物，譬如磷酸激酶，磷酸酶，泛素E3连接酶，SUMO E3连接酶，蛋白乙酰转移酶和蛋白甲基化酶等。我和我的同事发现蛋白芯片可以直接进行磷酸化，泛素化，乙酰化和SUMO化修饰反应研究，从而识别这些酶的直接蛋白靶标。应用蛋白质组芯片——正如这篇Cell文章一样，一个生物体或者蛋白质组中编码的绝大部分蛋白都可以用于检测酶-底物之间的相互关系，因此这是PTMs研究领域的一个直接的,全面的和公正的方法。近年来，许多文章报道了利用质谱分析全景解析细胞中的PTMs，也识别出了许多新的PTM位点，以及新的PTM类别。

但是质谱MS方法的一个最大弱点就是无法确定进行PTMs的上游酶。比如像磷酸激酶这样一个庞大的蛋白家族，利用传统方法几乎不可能识别出上游的效应因子。然而蛋白芯片方法的一个明显缺陷就在于其利用的是体外设备，蛋白芯片识别底物也许不能反映细胞体内发生的事件，因此需要体内校对。在这篇Cell文章中，研究人员通过NuA4复合物识别了91个体外底物，其中20个进行了体内方法检测，13个进行了细胞验证。但是仍然不能对所有底物同时进行深入研究，因此我们仔细挑选了一些。那些大规模，高通量方法的数据集中总是存在假阴性和假阳性结果，为了提高体内识别的准确度，可以寻找生物信息学的帮助。

生物通：贵研究组也采用了tandem mass spectrometry（串联质谱技术），这种技术是目前高通量蛋白质组学研究的核心技术，您在实验室中运用这种技术是否遇到了什么困难？如果有，具体是什么？

朱博士：我们的合作伙伴：赵英明（Yingming Zhao，音译）研究小组利用MS进行了Pck1乙酰化位点识别，我得说这是这项研究项目中最难克服的困难之一，因为任何目标蛋白PTM位点的识别实际上都是比较难以进行的。一个主要的原因是大部分情况下只有蛋白中的一小部分（<10%）被修饰，因此要鉴别出PTM位点既需要大范围覆盖性，又需要深入的MS分析。

生物通：有关NuA4复合物在酵母中的研究成果是否也适用于人类？

朱博士：当然也适用于人类。其实在这篇文章中，我们也分析了NuA4在人体中的同源物：TIP60复合物，并且发现这种物质也可以使hPCK1乙酰化，后者是酵母中Pck1的同源物。我们正与Dr. Jef Boeke的团队合作在人类蛋白芯片上进行TIP60乙酰化反应研究，近期将公布。

生物通：近年里表观遗传学逐渐成为一个热门研究话题，您认为未来表观遗传学研究的发展趋势是什么？
朱博士：表观遗传学研究将会越来越受到关注，20年前还没有人真正留意组蛋白的功能，更不用说与组蛋白有关的PTMs了。而现在呢，组蛋白PTM的研究已经成为了表观遗传学的一个主要分支。

生物通：目前市面上蛋白质组芯片技术产品参差不齐，您能给初接触蛋白质组学研究的新手介绍一些技术经验和选购经验吗？

朱博士：如果说的不是抗体芯片，那么目前主要只有两家公司销售蛋白芯片：Invitrogen公司（合并ABI后改名为Life Technologies）和北京华大基因公司（Beijing Genomics Institute，BGI）。Invitrogen公司相关的商品化产品是一个人类蛋白芯片（<8000个蛋白），这些蛋白是从昆虫细胞(SF9)中纯化得到的高品质蛋白，不过价格比较贵，大约需要1800美元一片。BGI也有一个人类蛋白芯片（<5000个蛋白），其价格就比较容易接受，因此可以考虑的选择并不多。

（生物通：王蕾）

附：

（约翰霍普金斯大学药理及分子科学系朱衡博士，
图片来源：http://www.hopkinsmedicine.org/pharmacology/research/zhu.html）

原文链接：

Protein Acetylation Microarray Reveals that NuA4 Controls Key Metabolic Target Regulating Gluconeogenesis

Histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) conduct many critical functions through nonhistone substrates in metazoans, but only chromatin-associated nonhistone substrates are known in Saccharomyces cerevisiae. Using yeast proteome microarrays, we identified and validated many nonchromatin substrates of the essential nucleosome acetyltransferase of H4 (NuA4) complex. Among these, acetylation sites (Lys19 and 514) of phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck1p) were determined by tandem mass spectrometry. Acetylation at Lys514 was crucial for enzymatic activity and the ability of yeast cells to grow on nonfermentable carbon sources. Furthermore, Sir2p deacetylated Pck1p both invitro and invivo. Loss of Pck1p activity blocked the extension of yeast chronological life span caused by water starvation. In human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells, human Pck1 acetylation and glucose production were dependent on TIP60, the human homolog of ESA1. Our findings demonstrate a regulatory function for the NuA4 complex in glucose metabolism and life span by acetylating a critical metabolic enzyme.