俞君英再发Science解析iPS

　　

生物通报道：2007年分别在线发表于《Cell》和《Science》的两项独立研究引起了生命科学界的震动：日本和美国科学家首次利用人体表皮细胞制造出了类胚胎干细胞。而国内生命科学界对于这项成果的密切关注还有一个原因，那就是《Science》的这篇由著名干细胞专家James Thomson领导完成的文章的第一作者是华人女学者俞君英。

1997年，俞君英自北京大学生物系毕业后赴美国宾西法尼亚大学攻读生物博士学位，从事胚胎克隆领域的研究。2003年进入汤姆森实验室工作，并转向以人体皮肤细胞改组为干细胞的研究。

2007年James Thomson研究组和Shinya Yamanaka研究组分别独立完成了首次利用人体表皮细胞制造出了类胚胎干细胞，前者利用的依然是此前的4种转录因子：Oct3/4，Sox2，c-Myc和 Klf4，导入方式也与此前的小鼠实验类似，只不过实现基因重组的细胞分别来自一位36岁妇女的表皮和一位69岁男性的结缔组织。而后者则独自确定了14种新的候选重组基因。通过系统的排除过程，他们最终也使用了4个基因——OCT3，SOX2，NANOG和LIN28，其中前两个和Yamanaka小组是相同的。他们利用的是胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞。

由于是从头开始的，因此作为研究思路确立和主体实验完成的主要执行人的俞君英付出了很多努力，她在2003年来到汤姆森实验室后，用整整2年时间作前期研究。她利用胚胎干细胞分化出血液细胞，再将血液细胞退化为干细胞，以此证明人体细胞通过基因改组可以转化为干细胞。从2005年开始，俞君英将精力全部扑在筛选改组皮肤细胞的特殊基因组合上。

但是这一成果仍然存在一些弊端，比如用于携带4种基因的逆转录病毒载体会导致由iPS细胞发育成的组织中出现肿瘤。因此在这两项成果公布后，许多实验室开始了探寻无毒iPS技术的道路。

要确保获得的多能干细胞不会朝着癌变的方向发展，最好是不引入外来的DNA（因为这些侵入的DNA会带来无数的可能性），要做到这一点并不容易，因为如果不引入DNA就很难完成重新编程的诱导过程。

这一次俞君英和她的同事们又做到了，文章再次发表在《Science》杂志上。作为这一最新文章的第一作者和通讯作者，俞君英在James Thomson等人的帮助下利用非整合型附着体载体（episomal vectors）方法获得了人类iPS细胞，在去除掉附着体后，这些iPS细胞就成为了没有外来DNA的iPS细胞，从而解决了可能癌变的问题。

最初获得人类iPS细胞的方法需要利用病毒载体，即将载体本身和转基因一同整合进基因组中，这些载体可能会导致插入突变，干扰iPS细胞的正常功能，而且残留的转基因表达也会影响分化，甚至导致肿瘤发生。之后有研究人员利用腺病毒载体获得了非整合载体，来源于肝脏细胞的小鼠iPS细胞，以及通过不断的转染质粒获得了来自胚胎成纤维细胞的iPS细胞，但是由于这些方法的低成功率，研究人员仍然不清楚这些需要长时间反应的方法对于人类细胞到底有什么影响。

近期有两种方法可以移除小鼠或人类iPS细胞种的转基因。一种是利用Cre/LoxP重组去除整合的转基因，这种方法能去除转基因序列，但是还是会将载体序列遗留下来。另一种方法则是利用piggyBac转座子切除来获得无载体和转基因的小鼠iPS细胞，但是目前还没有获得相关的人类iPS细胞成果，而且切除多个转座子是一件费时费力的事。

在这篇文章中，研究人员利用的一种简单的oriP/EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen-1)为基础的附着体载体转染方法。oriP/EBNA1载体来自EB病毒，非常适合于作为将重新编程因子引入人类体细胞的载体，因为这些质粒无需病毒包装就能转染，并且由于没有药物筛选性（drug selection），在培养过程中就能被去除。哺乳动物中oriP/EBNA1载体的染色体外稳定复制只需要一个顺式作用oriP因子和一个反式EBNA1基因，在每次细胞周期中也只复制一次，并且随着药筛逐渐去除。

因此利用这种方法，研究人员就能分离出不含质粒的细胞。这有利于未来iPS细胞在医疗方面的应用，也许通过干细胞分化出人体器官细胞，利用细胞移植治疗心肌损坏等疾病的这一天已经不远了。

（生物通：张迪）

原文摘要：

Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences