Nature专题：AIV绝密档案

　　

生物通报道，近期的人禽流感疫情，不禁绷紧了中国科学家的神经，也激起了全世界科研工作者对禽流感病毒的研究热情。因为，只有了解我们的敌人，才可能掌握御敌之术。本期的Nature推出了禽流感病毒研究的专题，最新一期的杂志上同时刊发了来自中国和法国科学家的禽流感病毒研究成果。

 

近期生物通专访禽流感国际权威专家管轶，具体报道请见：http://www.ebiotrade.com/custom/ebiotrade/H5N1/index.htm

 

两篇文章共同指向禽流感病毒结构研究，涉及病毒复制的结构是病毒的关键结构域，研究这些结构域有助了解禽流感病毒的复制过程，更重要的是对禽流感疫情具有指导意义，有利于禽流感疾病的防治。

 

这两篇独立完成的论文中，揭示出禽流感病毒（H5N1）聚合酶的关键部分，正是位于PA蛋白质的N端结构域。

 

第一篇是来自法国格勒诺布尔市欧洲分子生物学实验室的研究成果，科学家们发现了流感病毒控制人类细胞并把人类细胞用于它们自我复制机器的方式。原文标题：The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit。

 

他们找到了罪魁祸首，它是一种病毒酶，可能现在它已经成为制药专家专攻的目标。这种病毒酶靠近聚合酶，聚合酶就会控制着它的器官来合成病毒蛋白质。要想做到这一点，聚合酶必须去除细胞分子的一种叫做“帽”(cap)的基因标签。帽做着类似“授权钥匙”的工作，负责启动蛋白质合成机器，然后被加到聚合酶中。“抓帽者”是一种叫做PA的聚合酶亚基。

 

参与该研究的实验室之一，法国格勒诺布尔市欧洲分子生物学实验室的斯蒂芬·库萨克说：“对流感病毒控制人类细胞的新理解让PA成为一种很有希望的抗病毒目标。抑制cap的分裂是阻止流感传染的有效方法，因为流感病毒不能进行再繁殖。现在，我们知道研制新药该聚焦哪方面了。”

 

第二篇是来自中国科学院生物物理研究所饶子和与刘迎芳研究员的研究成果。原文标题：Crystal structure of an avian influenza polymerase PAN reveals an endonuclease active site。

 

在前期工作的基础上，进一步解析了该RNA聚合酶PA亚基剩余的氨基端（PAN）的高分辨率晶体结构，从而基本完成了对流感病毒聚合酶PA亚基的结构生物学研究工作。他们的研究结果清晰地揭示了PA蛋白具有核酸内切酶功能。这一结果推翻了以往报道的PB1亚基在聚合酶复合体中行使此项功能的推论。

 

这一结论首次清晰地揭示了PA参与病毒转录功能的一个重要分子机制，同时还首次证明了禽流感病毒RNA聚合酶中所具有的核酸内切酶功能是在PA亚基上，而不是在以往人们报道的PB1亚基上。这一研究结果不仅揭示了PA的功能机制，而且还为相关药物研发提供了一个新的原子水平的精细结构平台。

 

赛默飞世尔近期推出新产品，检测禽流感病毒速度可提高126倍

 

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赛默飞世尔公司产品KingFisher系列自动化磁珠提取纯化仪器，联合Invitrogen公司Ambion病毒RNA提取试剂盒，将传统方法的禽流感检测由21天缩短至4小时左右。此技术经过美国国家兽医服务实验室（NVSL）验证，是美国农业部认可的禽流感检测的分子生物学方法。该技术已由赛默飞世尔公司引进中国，将对促进我国禽产品的出口创汇、降低成本和疫情早期诊断具有重大意义。

 

禽流感快速高通量检测新技术是基于分子生物学的方法，在病毒感染的初期即可快速确诊病毒的存在。该方法包括两大主要步骤。第一步，联合使用赛默飞世尔公司的KingFisher自动化磁珠提取纯化仪器，及Invitrogen公司的Ambion病毒RNA提取试剂盒，进行自动化的病毒RNA提取。该步骤需要约30分钟。第二步，实时定量RT-PCR检测病毒RNA。该步骤需要约3小时。整体方法经过优化，并经过超过200,000禽类咽喉拭子样品的检测验证。

 

这项技术可以用于从生物体液和无细胞样品中，如血清、血浆、口腔拭子和细胞培养液中，提取病毒RNA。从无细胞样品中分离纯化RNA比从组织和培养细胞中分离纯化RNA更具挑战性。这是因为低的病毒滴度、大的操作体积和样品的复杂性，且操作步骤必须适合实时定量RT-PCR。使用自动化磁珠提取方法可满足上述各项要求，赛默飞世尔公司的KingFisher专利磁珠提取技术，不需有机溶剂或RNA沉淀步骤，消除了基于滤膜的方法经常碰到的问题，如滤膜堵塞、大的洗脱体积和不稳定的产率。而结合后续的实时定量RT-PCR，可仪检测到低至10拷贝的病毒RNA，极大提高了禽流感病毒检测的灵敏度。

 

禽流感快速高通量检测新技术比较传统方法的优势

• 灵敏度极高，可从100-400ul样品中分离到少至10拷贝的病毒RNA
• 对于96个样品，整个磁珠提取纯化过程不超过30分钟，整个禽流感检测过程不超过4个小时
• 用于低病毒浓度时尤其理想
• 线性纯化效率低至50转录子
• 经美国国家兽医服务实验室（NVSL）认证可用于AI/ND病毒

 

线性纯化效率可低至10拷贝的转录子

用MagMAX病毒RNA提取试剂盒，可以从血浆和血清中定量纯化病毒RNA，线性范围大于约5个数量级。这可由血浆、血清和水样品的试验体系中，以系列稀释的RNA作对照。图一的定量RT-PCR结果说明RNA的纯化率在很大的病毒浓度的范围内均为线性，含少至10个拷贝的转录子的样品也可被纯化。

 

基于磁珠的纯化技术的好处

磁珠用于从细胞中纯化RNA和从无细胞样品中纯化病毒RNA有许多好处。RNA产率更稳定，不仅是实验到实验间的差异极小，而且是大范围的样品尺寸所得到的RNA产率也很稳定。磁珠技术消除了因细胞聚集而产生滤膜堵塞的情况，因为高效的磁珠结合仅需很小体积的磁珠，所以结合的RNA用20-50ul的不含核酸酶的水就可以洗脱。这使得磁珠纯化技术对于从大体积、稀释样品中浓缩RNA极其有用。KingFisher（图二）专利的磁珠提取纯化技术，用转移磁珠代替了转移溶液，因此具有更高的提取纯化效率和产率。

                     

 

图一 病毒RNA提取效率  

图二 赛默飞世尔公司KingFisher Flex自动化磁珠提取纯化仪